腐植酸豆粕发酵活性肽在海刺参、基围虾、蓝子鱼生态养殖模式中的应用研究

薛德林 刘志国 关 蕾 索艳丽 孙向阳 潘华奇 胡江春

1 中国科学院沈阳应用生态研究所 沈阳 110016

2 辽宁威兰生物技术有限责任公司 沈阳 110022

3 大连翔华生物技术有限公司 大连 116222

腐植酸作为一种饲料添加剂，使用方便，价格低廉，同时具有特殊的功效和作用，是一种具有广阔应用前景的天然绿色饲料添加剂[1]。在豆粕发酵中添加腐植酸具有1+1≥2 的效果[2]。利用腐植酸的螯合特性能降解水体中毒素，抑制细菌、病毒，激活池水，调节pH 值，补充水体养分，吸附和分解氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等有毒有害物质；利用其络合特性能够调水、净水，络合重金属处理浑浊、泛底、死藻、油膜、泡沫等水质情况；利用其物理特性能够遮光，控制青苔生长，调整菌相、藻相和水色并改良底质泥土；利用其收敛特性能够调理海刺参肠胃，缓解白便，缓解中毒性肠炎、物理性肠炎等病症[1]。

近年来，在海产品养殖中，海刺参和基围虾是经济效益最佳的养殖品种。本试验针对一种创新型的腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌与海刺参、基围虾、蓝子鱼混套养模式[2]，研究和分析其增产效果、经济效益等，为参、虾、鱼混套养模式在辽宁、山东、河北等海参养殖区域推广和应用提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌种

（1）丁酸梭菌（Closhridium butyricum）：从中国工业微生物保藏管理中心购买。丁酸梭菌是专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，在肠道内能代谢产生多种B 族维生素、维生素E 和酶类物质，厌氧发酵过程中能产生大量淀粉酶，水解淀粉和糖类的最终代谢产物为乙酸、丙酸、丁酸等，其比例为10%∶13%∶68%；发酵终点为pH 3.5，有机酸50%；可有效改善养殖动物肠道健康，供给肠道内益生菌能量，增强免疫力，促进生长。

（2）植物乳杆菌（Lactobacillus acidophilusCICC 6074）：从中国工业微生物保藏管理中心购买。植物乳杆菌兼性厌氧发酵，能产生大量乳酸，抗菌肽、蛋白酶和生物活性物质。

（3）贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）：从中国工业微生物保藏管理中心购买。好氧发酵，生长速度快，易于培养，能够充分利用有机氮，能分泌产生多种生物活性物质、脂肽类抗生素和激素。

（4）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis2018）：从辽宁大连黄海海域底泥中分离得到。好氧发酵，可产生活性肽，能充分利用有机氮和含硫物，分解粪便和残余饵料，降解氨氮、硫化氢和亚硝酸盐。

（5）海洋胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa2019）：从辽宁大连渤海海域大连瓦房店谢屯五岛海参养殖场海参圈中分离得到。好氧发酵，产生多种酶类物质，类胡萝卜素和虾青素，有很好的诱食效果。

1.1.2 供试发酵原料

（1）腐植酸：从内蒙古霍林河郭勒树艳腐植酸公司购买。腐植酸含量≥60%，细度≤80 目，水分≤15%，pH 5.0。腐植酸参与发酵可以产生生物活性物质，具有收敛、解毒、消炎、止痢、替抗等功能。

（2）豆粕：黑龙江省九三油脂集团生产，市售。颜色为浅黄色，有大豆香味。成分：蛋白质50%、赖氨酸3.0%、色氨酸0.7%、蛋氨酸0.9%、水分≤10.0%。

（3）精氨酸发酵液浓浆粉：从河北精晶药业科技股份公司购买。蛋白质含量≥52%、碳水化合物（糖）≥8.0%、总磷含量≥1.0%、灰分≤5.0%、水分≤8.0%、细度≤100 目。

（4）麦麸皮：五得利面粉集团有限公司生产，市售。蛋白质13.6%、脂肪5.0%、碳水化合物64.5%、水分≤10.0%。

1.1.3 供试设备

（1）微生物发酵罐：汇森生物设备（镇江）有限公司。

（2）微生物固体发酵器：上海鹏平生物设备制造公司。

（3）低温负压流化床：上海鹏平生物设备制造公司。

（4）微粉机：上海春谷粉碎机制造公司。

1.1.4 供试养殖苗种

（1）海刺参：大连翔华生物技术有限公司万众海参养殖场，自繁。

（2）基围虾：海南腾海水产科技有限公司，外购。

（3）蓝子鱼：福建漳州东山养殖公司，外购。

1.2 腐植酸豆粕发酵活性肽产品生产工艺

以腐植酸、豆粕为发酵原料与丁酸梭菌等5 种菌液混合进行固体发酵，低温烘干粉碎，得腐植酸豆粕发酵活性肽产品。其生产工艺为：菌种活化→液体发酵→固体料与液体菌种混合→微生物固体发酵器中发酵→低温负压流化床烘干→微粉机粉碎→产品保证值检测。

1.2.1 液体发酵

（1）丁酸梭菌培养与发酵：丁酸梭菌菌种1 支→1000 mL 三角瓶10 瓶（厌氧培养48 h）→500 L 发酵罐（厌氧发酵24 h）→5 T 发酵罐（厌氧发酵72 h）。发酵罐液体发酵培养结束后，用平皿培养法检测，丁酸梭菌培养密度不低于20×108cfu/mL 为合格产品，无菌密闭条件下灌装到5 L 或10 L 塑料瓶中，即得到丁酸梭菌WL21-01 生物制剂，入库备用。

（2）植物乳杆菌：培养过程同丁酸梭菌。区别为：培养基不一样，培养方式兼性厌氧，保压不通气。植物乳杆菌培养密度不低于80×108cfu/mL为合格产品。

（3）贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌：培养基中C/N=1/5，培养方式好氧发酵，莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌培养密度不低于200×108cfu/mL为合格产品。

（4）海洋胶红酵母：培养基中C/N=3/2，培养方式好氧发酵，培养密度不低于20×108cfu/mL为合格产品。

1.2.2 固体发酵

（1）液体菌种与原料混合比例：50 ∶100。（2）5 种液体菌种混合比例：1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1。

（3）4 种发酵原料混合比例：1 ∶1 ∶1 ∶1。

（4）固体发酵：液体菌种和发酵原料放入到固体发酵器中，经好氧、厌氧发酵过程，温度控制在38 ～50 ℃之间，发酵时间100 h。

1.2.3 烘干粉碎和产品保证值

（1）烘干：经低温负压流化床烘干，入口温度为100 ℃，出口温度为40 ℃，物料流化时间为12 min。（2）粉碎：微粉机粉碎到200 目，得到腐植酸豆粕发酵活性肽。

（3）产品保证值检测依据：粗蛋白按照饲料中粗蛋白测定方法（GB/T 6432—1994）进行测定；小肽按照饲料中酸溶蛋白的测定方法（GB/T 22492—2008）进行测定（小肽分子量小于2000 道尔顿）；酸度按照食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定方法（GB 5413.34—2010）对饲料中酸度进行测定；氨基酸（赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸）按照饲料中氨基酸的测定方法（GB/T 18246— 2000）进行测定；挥发性盐基氮按照饲料中挥发性盐基氮的测定方法（GB/T 32141—2015）进行测定；水分按照饲料中水分的测定方法（GB/T 6435—2014）进行测定。pH 值按照水产品卫生标准的分析方法（GB/T 5009.45—2003）进行测定。

（4）腐植酸豆粕发酵活性肽产品保证值测定结果见表1。

表1 腐植酸豆粕发酵活性肽产品保证值Tab.1 Guaranteed value of humic acid soybean meal fermentation peptide products

2 试验设计与方法

试验时间：2021 年5 月20 日—10 月20 日。

试验地点：在辽宁省大连市普湾新区皮口社区万众海产品养殖区（东经122°21′，北纬39°34′）进行，海刺参收获2次、基围虾收获多次、蓝子鱼收获1 ～2 次。试验设计方案见表2。

表2 腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌试验设计方案Tab.2 Experimental design of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum

蓝子鱼投放水温应稳定在18 ℃以上。水温超过20 ℃时，水草、藻类、青苔生长较旺盛，全池覆盖率60%，每亩投放蓝子鱼苗0.1 kg（300 元/kg）折合投入30 元/亩，投苗规格为每1000 尾/kg；覆盖率低的可以按比例减少投放鱼苗尾数。蓝子鱼啃食草、藻、苔生长，排出的粪便通过微生物作用分解，化害为宝，既消除了粪便对水草、藻类、青苔的威胁又增加了微生物群体的数量，为海刺参的生长提供优质的动物蛋白饵料，促进水生环境的生态平衡。

秋季水温低于15 ℃时，蓝子鱼开始大量死亡，此时蓝子鱼规格大约每尾0.20 ～0.25 kg，在此之前必须将鱼捞出，出售。

3 结果分析

3.1 腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海刺参、基围虾、蓝子鱼产量的影响

腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海刺参、基围虾、蓝子鱼产量的影响结果见表3。可以看出，试验组1 与对照组相比，海刺参增重37.0 kg/亩，基围虾增重2.6 kg/亩，蓝子鱼增重1.9 kg/亩；试验组2 与对照组相比，海刺参增重41.9 kg/亩，基围虾增重2.6 kg/亩，蓝子鱼增重2.3 kg/亩；试验组3 与对照组相比，海刺参增重49.0 kg/亩，基围虾增重4.0 kg/亩，蓝子鱼增重2.7 kg/亩，海刺参增重率提高26.46%～34.48%；基围虾增重率提高23.63%～36.36%，蓝子鱼增重率提高38.0%～54.0%。

表3 腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海刺参、基围虾、蓝子鱼产量的影响Tab.3 Eff ects of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on the yield of sea stichopus, basal shrimp and siganid f ish

3.2 腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海参圈理化指标的影响

腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海参圈中硫化氢、氨氮、亚硝酸盐、溶解氧、pH 值等理化指标的影响结果见表4。可以看出，与对照组相比，投放腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌后，海参圈中硫化氢降低0.003 ～0.010 mg/L，氨氮降低0.04 ～0.21 mg/L，亚硝酸盐降低0.013 ～0.024 mg/L，溶解氧提高1.10 ～3.36 mg/L，pH 值趋于稳定，透明度提高14.6 ～29.8%，浊度降低1.9 ～8.3%，底栖硅藻增加2 ～7 g/m2。

表4 腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海参圈理化指标的影响Tab.4 Eff ects of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on physical and chemical indexes of sea cucumber ring

3.3 腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海刺参、基围虾、蓝子鱼养殖模式经济效益分析

腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海刺参、基围虾、蓝子鱼生态养殖模式经济效益的分析结果见表5。可以看出，试验组1 投入成本增加600 元/亩，收入增加6374 元/亩，净收益增加5774 元/亩；试验组2 投入成本增加1200 元/亩，收入增加7198 元/亩，净收益增加5998 元/亩；试验组3 投入成本增加1500 元/亩，收入增加8406 元/亩，净收益增加6906 元/亩，效果最好。

表5 腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌对海刺参、基围虾、蓝子鱼养殖模式经济效益分析Tab.5 Economic benef it analysis of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on the culture model of sea stichopus, basal shrimp and siganid f ish

3.4 海参圈投入产出情况统计分析比较

海参圈投入海刺参苗重量、规格及其分布和投入产出情况统计分析比较结果见表6。可以看出，海参圈投入海刺参苗重量34 kg/亩以上，规格是大中小均有，数量是大小均匀分布，呈现一种合理的分布状态，海参圈产出成品参重量188 kg/亩以上。海参圈海刺参幼稚参投入重量与产出成品参重量比为1 ∶5.53（投入1 kg 幼稚参，产出5.53 kg 成品参）。

表6 海参圈投入海刺参苗重量、基围虾虾苗数量及其投入产出情况统计分析比较Tab.6 Statistical analysis and comparison of seedling weight of sea stichopus, seedling number of basal shrimp and its input-output in sea cucumber ring

4 结果与讨论

（1）在海刺参养殖中混套养基围虾、蓝子鱼，以腐植酸豆粕发酵活性肽20 kg/ 亩、丁酸梭菌5 kg/ 亩和植物乳杆菌5 kg/亩用量，并按照潮汐期规律使用6 次，能够有效调整水体中的C/N 营养比例，促进有益微生物繁殖生长，调整和改善水体颜色，稳定水质，增产增收[2，3]。

（2）本试验结果表明，腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳杆菌可以使海刺参增重率提高26.46%～34.48%，基围虾增重率提高23.63%～36.36%，蓝子鱼增重率提高38.0%～54.0%。经测定，与对照组相比，试验组海参圈理化指标均有变化：硫化氢降低0.003 ～0.010 mg/L、氨氮降低0.04 ～0.21 mg/L、亚硝酸盐降低0.013 ～0.024 mg/L、溶解氧提高1.10 ～3.36 mg/L；pH值稳定在8.15 ～8.20 之间、透明度提高14.6 ～29.8%、浊度降低1.9 ～8.3%、底栖硅藻增加2 ～7 g/m2。从经济效益看，试验组3 效果最好，投入成本增加1500 元/亩，收入增加8406 元/亩，净收益增加6906 元/亩；海刺参苗种重量投入产出比为1 ∶5.53。

（3）在本研究中，海参圈水体和底泥中的动物粪便和残余饵料，腐烂后会产生硫化氢发黑发臭，滋生病菌，生成大量的氨氮和亚硝酸盐，当亚硝酸盐浓度超标时，就会造成养殖动物的死亡。贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌均为好氧菌，能加速参池底部堆积有机物的分解，将大分子有机物降解为多肽等小分子有机物，再降解成为氨基酸、单糖等，最终分解为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐等物质，使海参圈中的化学需氧量，生物需氧量降低，水质得到有效改善。同时，海参圈中有大量的单细胞藻类等浮游植物，可以作为海刺参的食物。浮游植物又可以通过光合作用产生大量氧气和糖类等有机物，这为栖息在底部的海刺参的呼吸、有机物的分解提供了氧气，由此使海参圈形成一个良好的微生态循环系统[3～5]。

（4）植物乳杆菌繁殖过程中产生的酸性物质能降解重金属，产生的乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂，也能很好地抑制底部粪便和残饵料的腐烂，降低了氨氮和亚硝酸盐的增加，减少了化学降氮增氧剂的用量，使其养殖成本降低，如果长期使用丁酸梭菌能为植物乳酸菌等肠道益生菌的生长繁殖提供能量，二者优势互补、相互促进，共同构建肠道优势菌群，护卫肠道安全[1，6]。

（5）有益微生物菌群作为辛勤的“清道夫”和“肠道卫士”，清理底泥中发黑发臭腐烂物、氨氮、亚硝酸盐和硫化氢，同时益生菌菌体蛋白为海刺参提供良好的养殖环境和优质营养源。蓝子鱼作为辛勤的“园丁”，啃食水草、大型藻类、苔藓，将其转化成粪便，通过微生物作用将粪便分解，化害为宝，既消除苔、藻、草的威胁又增加了微生物群体的数量，为海刺参的生长提供优质的动物蛋白饵料。同时，增加腐植酸使用量，降低光照强度，可以控制苔藓、大型藻类、杂草等植物的生长，降低雇佣潜水员捞草的人工费用和使用化学药品杀草对池底的污染和对生态平衡的破坏[1，2，6]。

（6）本试验将腐植酸豆粕发酵活性肽、丁酸梭菌和植物乳杆菌应用于海刺参、基围虾、蓝子鱼混套生态养殖模式，在辽宁、山东和河北等地海参养殖区域推广应用，将会带来可观的经济效益。