氧化-碱化联合活化腐植酸机制及其对氮素利用率的影响

沈玉文 李国栋 林海涛 高文胜 刘兆辉*

1 养分资源高效利用全国重点实验室，农业农村部废弃物基质化利用重点实验室，山东省环保肥料工程技术研究中心，山东省农业科学院农业资源与环境研究所 济南 250100

2 山东省农业技术推广中心 济南 250014

近年来，为了提高风化煤中腐植酸的提取效率，并赋予腐植酸盐其他功能，有研究者对活化技术做了进一步改进，如采用氢氧化钠和尿素为活化剂制成的腐植酸脲溶液对肥料进行包膜来制备缓控释肥料[1]，不但显著提高了腐植酸的提取率，而且大大降低了氢氧化钠的用量。此活化技术的不足之处是，仅将大部分的游离态腐植酸转化为溶于水的腐植酸盐，并没有显著提高腐植酸含氧官能团数量，对风化煤活化效果低于氧化法效果[2]。因此，我们准备采用氧化和碱化法联合的方式对风化煤进行活化，以显著提高其水溶性腐植酸含量。

本文采用氧化-碱化联合方法活化风化煤来提高水溶性腐植酸含量并明确其活化机制，进一步与尿素结合得到一种活性腐植酸缓释肥料——腐植酸尿素，通过结构表征、土壤培养试验、淋洗等手段明确氧化-碱化联合活化腐植酸产品对提高氮素利用率效果的影响，并进一步探讨其增效机理。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

本试验选取的风化煤来自内蒙古乌海市，粒度小于10 目，含水量约15 ～20 wt%，总腐植酸含量为72.5 wt%，其中的水溶性腐植酸含量为5 wt%。

供试土壤采集于黄河下游济阳地区的冲积土，土壤类型为潮土。从0 ～20 cm 深度的不同位置随机采集土壤样本，并汇集形成复合土壤样本。土壤样本被放在塑料袋中，用冷却器送回实验室，在进一步分析之前通过2 mm 尼龙筛。供试潮土的物理化学性质见表1。

表1 潮土物理化学性质Tab.1 Physical and chemical properties of tidal soil

1.2 活化腐植酸材料及腐植酸尿素制备

将风化煤、8 mol/L 浓硝酸和KOH 固体按重量比为1 ∶0.2 ∶0.1 的比例混合，得到混合料，然后将混合料与水按重量比1 ∶0.3 的比例搅拌均匀后置于180 ℃陈化12 h，然后冷却、干燥、粉碎，得到活性腐植酸。

将活性腐植酸和尿素以1 ∶3 的重量比混合，再在120 ～130 ℃熔融，冷却后制备出腐植酸尿素产品。

1.3 腐植酸活化前后结构及热力学性质表征

采用傅里叶红外光谱仪（FT-IR，VERTEX-70/70v，德国布鲁克光学公司）获得400 ～4000 cm-1波长范围内非常细的粉末样品的FT-IR 光谱。

采用热重分析法（TG，DSC 250）测定不同物质的热量和质量的准确变化。将样品加入铝锅中，在试验过程中密封。在25 ～500 ℃的温度范围内，以10 ℃/min 的加热速率（由液氮控制）记录TG谱图。

1.4 土壤理化性质及酶活性表征

将112 组风干土样（各200 g）分别放入300 mL塑料容器中，与去离子水混合，使土壤持水率达到40%。所有容器都覆盖有10 个孔的塑料薄膜，以允许气体交换，同时将水分损失降至最低。这些样品在25 ℃下预培养1 周，以减少由于试验开始时干燥土壤的复湿而引起的微生物活性变化。平衡期结束后，建立4 个处理，分别为不施氮肥（CK）、尿素（U）、腐植酸（F，0.278 mg HA/g 土壤）和腐植酸尿素（FU）。U 和FU 处理氮素浓度一致，均为500 μg N/g 土壤。在整个试验过程中，每4天补充一次水分，使土壤含水量保持在土壤持水量的60%左右。采用完全随机区组设计，评估4 组土壤理化和微生物特性的显著差异。所有土壤样品在25 ℃下培养，在培养的第0、1、3、7、15、30和90 d 测定脲酶活性和理化性质。

采用自动流动注射分析仪（Foss FIA 5000，丹麦）测定土壤样品中硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）含量；用96 孔微孔板法测定土壤样品的酶活性[3，4]；以尿素为底物，测定脲酶活性；在578 nm 波长处测定了光强。

1.5 土壤室内淋洗试验

主体是PVC 管柱、土柱、定制不锈钢架。玻璃柱的内径、外径和高分别为11、12、50 cm。在淋溶柱底部放置滤纸和1 层200 目的滤布。每柱中装入4 kg 过2 mm 筛后的风干土壤的土肥混合物。淋溶时用医用输液管，减缓水在土壤中的渗透速度增强淋溶的效果，加水时可起到缓冲作用，以防止土壤冲散影响淋溶效果。

采用间歇淋溶法，淋溶前加1200 mL 水使土壤水分接近饱和持水量，室温下放置1 d，使土肥充分混合。首次淋溶加入500 mL 水，收集24 h 淋溶液，每次淋溶过程相同，在培养第2、8、14、20 和26 d 时进行连续5 次淋溶。

1.6 数据分析

原始数据经Excel 2016 汇总整理后，采用方差分析法（ANOVA）研究了不同处理对土壤理化性质和酶活性的影响。采用Duncan 试验来确定不同处理方法之间的差异。用OriginPro 8.0 对试验数据进行作图。

2 结果与讨论

2.1 活化前后腐植酸含量变化

与传统碱化活化方法相比（表2），采用氧化-碱化联合活化方法可使风化煤中水溶性腐植酸盐的活化率提高26%～38%，提取的大部分水溶性腐植酸盐在陈化12 h 后仍能稳定存在，不仅显著提高了水溶性腐植酸含量，还解决了氨化法效果不稳定的问题，便于后续的肥料造粒工艺。

表2 风化煤中水溶性腐植酸提取量Tab.2 Extraction amount of water soluble humic acid from weathered coal

2.2 活化前后腐植酸结构及热力学性质分析

浓硝酸作用下，风化煤中芳核上氢可以被硝基离子取代而硝化，从而提高活化后风化煤水溶性腐植酸含量，但风化煤中羧基含量较多，羧基无法被硝化，但可通过加入KOH，生成羧酸盐的方式提高水溶性腐植酸盐的含量。在氧化-碱化联合作用下，风化煤中腐植酸在活化前后必定产生官能团变化以及随之而来的热力学稳定性变化。因此，我们采用FT-IR 和TG 分析表征了风化煤中腐植酸活化前后官能团及热力学稳定性变化，并进一步明确活化后腐植酸水溶性提高的原因。

2.2.1 活化前后腐植酸FT-IR

采用氧化-碱化联合方法活化前后腐植酸FT-IR 如图1 所示。活化后，样品的FT-IR 发生了多处显著变化，证明活化后腐植酸分子结构变化显著。如图1b，在3694.87 cm-1新出现的峰为硝酸氧化下与腐植酸分子形成伯胺或伯酰胺的N-H 伸缩振动峰；在2919.04 和2849.98 cm-1处新出现的峰为羧酸羟基伸缩振动峰，说明硝酸氧化后，不仅硝酸中的氮进入了腐植酸分子中，腐植酸分子中羧基数量显著增加，这也是活化后水溶性腐植酸含量显著增加的重要原因。在图1b 中新出现在1191.08、1107. 81 和1034.10 cm-1处的峰均属于C-N 拉伸振动峰，证明硝酸中的氮不仅与腐植酸分子端基发生反应，还进一步进入了腐植酸碳链中。

图1 氧化-碱化联合活化前（a）和活化后（b）腐植酸FT-IRFig.1 FT-IR of humic acid before (a) and after (b) activation by oxidation-alkalization combination

2.2.2 活化前后腐植酸热力学性质变化

采用氧化-碱化联合方法活化前后TG 分析曲线如图2 所示。图2a 中，在35 ～298 ℃范围产生23.61%的失重量，主要是由风化煤中水分丧失造成，在298 ～500 ℃产生16.03%的热失重，主要是由于有机分子链脱氢和氨基、羰基和烷氧基官能团的分解所致。图2b 中，发现有机分子链脱氢和氨基、羰基和烷氧基官能团的热失重起始温度降低到220 ℃，说明活化后腐植酸分子热稳定性降低，很可能是活化后腐植酸分子量减小导致的。

图2 氧化-碱化联合活化前（a）和活化后（b）TG 分析曲线Fig.2 TG analysis curves before (a) and after (b) activation by oxidation-alkalization combination

综上所述，活化后腐植酸分子由原来的大分子变为多个小分子，胺基、羧基、羟基等亲水官能团增多，氮原子不仅进入端基，也进入了分子碳链，从而提高了水溶性腐植酸含量。

2.3 腐植酸尿素对土壤脲酶活性影响

脲酶是一种催化尿素水解生成氨和碳酸盐的酶。大量研究表明，脲酶活性与合成氮肥的施用量成反比[5]。脲酶活性的降低可以解释为硝化和反硝化作用的激活抑制了脲酶的产生[6]。氮肥对脲酶活性的抑制作用可能是由于最终产物NH4+-N所致。

Bollmann 等[7]曾报道，褐煤作为腐植酸的原料掺入土壤抑制了土壤中的脲酶活性。本研究发现，随着尿素与活化后腐植酸结合成腐植酸尿素产品的施入，土壤中的脲酶活性显著降低。如图3 所示，向土壤单施尿素，会显著抑制土壤中脲酶活性，而施用腐植酸尿素处理（FU），土壤脲酶活性比单施尿素处理还要低，说明施用腐植酸尿素产品具有缓释氮肥的效果。

图3 4 种处理土壤脲酶活性随时间变化趋势Fig.3 Variation trend of soil urease activity under four treatments with time

2.4 腐植酸尿素对土壤氮素淋溶影响

尿素施入土壤后，在脲酶的作用下水解为铵态氮，并进一步被土壤中硝化细菌氧化成硝态氮。由于土壤带负电，因此对硝态氮不会产生吸附作用，大量的硝态氮会通过土壤淋溶作用进入地下水，产生严重的地下水硝酸盐污染，是引起农业面源污染的重要原因。近年来，科学家们通过多种途径提高氮素利用率，减少氮素淋溶[8~13]，本研究将腐植酸尿素产品替代传统尿素进行农业生产就是一种有效减少土壤氮素淋溶的方法。

图4 、图5 显示的是土壤铵态氮和硝态氮淋溶量随时间变化趋势。结果表明，与单施尿素相比，施用腐植酸尿素产品可以显著降低土壤NH4+-N 和NO3--N 含量。初步认为是腐植酸尿素抑制脲酶（图3）和尿素与腐植酸之间的化学反应（氢键等）的结果[14]，二者都可以降低尿素水解。腐植酸具有丰富的羧基、羟基和酚羟基，可以提供大量的阳离子交换位点来保留NH4+[15]。因此，腐植酸尿素处理的土壤中，NH4+-N 淋出量远低于仅施用尿素处理的土壤，它还具有减少土壤中NH3挥发的潜力。4 个处理中土壤NO3--N 淋出量均在培养的第7 天达到最大值。单施尿素土壤中NO3--N 淋出量在几乎所有处理中最高，施用腐植酸尿素处理NO3--N 淋出量显著低于尿素处理。在腐植酸尿素处理中，NH4+-N 转化为NO3--N 的速率降低，这是由于NH4+-N 在腐植酸尿素处理中被固定了，减少了其转化为NO3--N 的总量。

图4 4 种处理土壤NH4+-N 淋失量随时间变化趋势Fig.4 Variation trend of the content of NH4+-N leaching soil under four treatments with time

图5 4 种处理土壤NO3--N 淋失量随时间变化趋势Fig.5 Variation trend of the content of NO3--N leaching soil under four treatments with time

综上所述，与单施尿素相比，腐植酸尿素处理能够降低土壤氮素淋溶量，提高氮素利用率。

3 结论

风化煤中腐植酸的高效活化可以通过以下3种措施实现[2]：（1）增加结构单元上的活性官能团数量；（2）使官能团处于亲电或亲核状态，或通过引入相关原子或原子团，提高官能团反应能力；（3）切断化学键，降低分子量。本文通过氧化-碱化联合方法活化风化煤，一方面通过硝基引入，取代风化煤中腐植酸芳核上氢而硝化，同时通过硝酸氧化作用，切断化学键，将复杂的大分子腐植酸变为比较简单的小分子量物质，从而提高活化后风化煤水溶性腐植酸含量；另一方面，风化煤腐植酸中羧基含量较多，羧基无法被硝化，通过加入KOH，生成羧酸盐的方式提高水溶性腐植酸盐的含量。通过FI-IR、TG 表征结果证明，活化后腐植酸分子量降低，羧基、羟基等水溶性官能团增多，氧化剂硝酸中的氮不仅进入腐植酸端基，还进入到腐植酸碳链，从而提高了腐植酸分子的水溶性，验证了我们的假设，明确了其氧化-碱化相协同的活化机制。

将得到的活性腐植酸产品与熔融尿素制备成腐植酸尿素，通过土壤培养试验发现，与传统尿素相比，腐植酸尿素可以显著抑制土壤中脲酶活性。已有研究证明[16]，腐植酸中官能团与脲酶中硫醇基作用形成复合物，从而抑制脲酶活性，减缓土壤中酰胺态氮向铵态氮、铵态氮向硝态氮的进一步转化。土壤淋洗试验表明，施用腐植酸尿素，土壤淋溶中硝态氮和铵态氮含量均低于常规尿素处理。因此，通过氧化-碱化联合活化腐植酸进一步制成的腐植酸尿素，能显著抑制土壤脲酶活性并显著降低土壤硝态氮和铵态氮的淋溶量，从而提高氮素在土壤中利用率，具有作为增效氮肥的广泛应用市场。