6-芳基-β-咔啉衍生物的合成及抗肿瘤活性研究

王兆旭,郭亮,孙跃,张俊婷,张洁

(石河子大学化学化工学院/新疆兵团化工绿色过程重点实验室,新疆 石河子 832003)

根据世界卫生组织2020年的统计,癌症仍是近年来阻碍我国以至世界人口平均寿命提高的重要因素。目前,全球癌症患者基数庞大且死亡率高,我国的癌症病例和癌症死亡率均占全球的四分之一左右,受到的影响尤为显著[1]。目前,化疗是癌症治疗的主要措施之一,但已知药物仍存在副作用大,疗效不理想等问题,尤其是多耐药肿瘤细胞株的出现加剧了癌症治疗难度,急需开发新型抗肿瘤药物。天然产物是抗肿瘤以及其它药物先导化合物的主要来源之一,多种生物碱类化合物具有良好的抗肿瘤潜力[2-3]。

β-咔啉生物碱是吲哚类生物碱的重要分支,其母体结构具有广泛的生物活性[4-9],是一种良好的药物骨架。多种天然β-咔啉生物碱具有良好的抗肿瘤活性[10-12],由于β-咔啉修饰位点的多样性,通过结构修饰已获得多种活性优异的抗肿瘤先导化合物[13-15]。目前的报道中,对β-咔啉环的修饰多集中于C1、N2、C3、N9位点,对C5、C6、C7、C8位点的报道较少。天然β-咔啉生物碱Eudistomidins (B-D, J)(图1)对多种肿瘤细胞系具有良好抑制活性,其C6位取代基对该系列化合物抗肿瘤活性具有潜在贡献。近期,有报道称C6、C7和C8取代的β-咔啉具有细胞毒性[16]。本课题组前期对β-咔啉类化合物进行了大量的合成及生物活性研究[17-22],曾在β-咔啉的C6位引入N-芳基取代基,并获得了具有较强抗肿瘤活性的化合物单体[23]。在此基础上,本文设想在β-咔啉的C6位引入取代芳基,以期得到具有良好抗肿瘤活性的先导化合物。

图1 天然产物Eudistomidins (B-D, J) 的结构

为了设计一系列新型C6位取代的β-咔啉化合物,本文以1-甲基-β-咔啉为母核结构,通过溴原子为媒介,借助Suzuki反应在β-咔啉的C6位引入多种取代苯基,合成了21个新型6-取代-β-咔啉衍生物,合成路线见图2,图3。并评估了它们对A549、BGC-823、CT-26、Bel-7402 和MCF-7的体外抗肿瘤活性。

图2 中间体4,5a, 5b的合成路线

图3 目标化合物6a-6u的合成路线

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

L-色氨酸、二氧化锰、N-溴代丁二酰亚胺(NBS)、四-(三苯基膦)-钯、苯硼酸、4-甲氧基苯硼酸、4-氟苯硼酸、4-(三氟甲氧基)苯硼酸、4-(三氟甲基)苯硼酸、3,4,5-三氟苯硼酸、4-氰基苯硼酸、磷酸钾、碳酸钾、碳酸铯、氟化钾、氢化钠、钯/碳、醋酸钯、无水乙醇、乙酸乙酯(分析纯,上海泰坦科技股份有限公司);乙醛、二氯甲烷、石油醚、甲醇(分析纯,上海麦克林生化科技有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);RPMI-1640培养基、青链霉素混合液双抗(索莱宝(北京)科技有限公司);胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(Bio-Rad公司)。

仪器:ADVANCE 400型核磁共振波谱仪(瑞士Brucker公司);LTQ Orbitrap XL型质谱仪(赛默飞世尔科技公司);FA2004型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);X-5型显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司);WS70-1型红外快速干燥箱(巩义市予华仪器有限公司);IKA RV8型旋转蒸发仪(德国IKA公司);IKA VACSTAR digital 真空泵(德国IKA公司);IKA RCT basic 磁力加热搅拌器(德国IKA公司);ZF-I型三用紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂);Bio-Rad 全自动酶标仪(美国伯乐公司)。

1.2 6-芳基-β-咔啉衍生物的合成

1.2.1 中间产物的合成

中间体2-4的合成方法:根据文献报道方法[23-24]合成中间体2-4合成路线见图2。中间体4为棕色固体,mp 180.2-182.8 ℃。

中间体5a,5b的合成方法:称取中间体4(1 mmol),NaH (2 mmol),于250 mL单口瓶中,加入DMF混合搅拌,混合物室温搅拌2 min后加入碘甲烷或五氟溴苄 (1.2-2 mmol) 室温反应,待反应完全后将反应液倒入冰水中猝灭反应,乙酸乙酯萃取 (300 mL×3),合并有机相,饱和食盐水洗涤,有机相加入乙醇(450 mL)、浓盐酸 (0.5 mL),减压浓缩后加入少量丙酮在-10 ℃下冷藏过夜,抽滤,少量丙酮洗涤,滤饼溶于水中,碳酸氢钠调pH值大于8,加入乙酸乙酯(300 mL×3)萃取,合并有机相用饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥,减压浓缩,得到关键中间体5a,5b。

1.2.2 目标化合物(6a-6u)的合成

以Suzuki反应常用条件为基础,以6-溴-1-甲基-β-咔啉(4)和苯硼酸为原料,以Pd(PPh3)4为催化剂,对溶剂、碱等条件进行了优化(表1)。使用氮气保护时,即使置换多次(8-10次)仍会产生部分较难的副产物,改用氩气保护时,此类副产物几乎不产生。并且,在常用剂量催化剂(5 mmol%)、碱(0.4 mmol)的下原料无法反应完全,增加剂量至催化剂(10 mmol%)、碱(0.6 mmol)时原料可反应完全。在乙二醇二甲醚(DMA)为溶剂的条件下,对该反应常用碱的种类进行了筛选,其中在K3PO4下的产率最优,在K2CO3的条件下无法反应完全,在Cs2CO3、CsF的条件下有不同程度的副产物产生。之后对溶剂进行了筛选,常用溶剂中,以乙二醇二甲醚为溶剂产率最优。其在乙腈中产率有所降低,在DMF中有大量副产物生成。有文献报道称体系中加入一定量的水对Suzuki反应有积极影响。因此,尝试了乙二醇二甲醚/水、乙腈/水两种溶剂体系,加入水后反应的速率和产率都有一定程度的提升,其中乙二醇二甲醚/水体系产率最优为94%。此外,我们还尝试了Pd(OAc)2和Pd/C两种无配体催化体系,其中Pd(OAc)2为催化剂时反应不能发生。以Pd/C为催化剂时,在空气气氛下反应,虽能以良好产率得到目标化合物,但不能达到条目5产率。

表1 反应条件优化

以6-苯基-1-甲基-β-咔啉(6a)的合成为例,称取中间体6-溴-1-甲基-β-咔啉(4) (261 mg, 1 mmol),苯硼酸(145 mg, 1.2 mmol),K3PO4(690 mg, 4 mmol)和Pd(PPh3)4(114 mg, 10% mmol)于反应管中,通氩气置换3次,用注射器加入乙二醇二甲醚(4 mL)和水(4 mL),80 ℃反应10 h,TLC监测反应进程。反应完毕后,将反应液倒入水中,乙酸乙酯萃取(100 mL×3),饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥,减压浓缩,柱层析纯化获得目标产物6a。以相同方法制备其余目标产物。为了研究各类取代基对抗肿瘤活性的影响,我们选择了无取代、具有吸电子取代基和供电子取代基的苯基结构,以研究取代基电子效用的影响。此外,由于氟原子在药物领域具有重要地位,已上市药物中含氟药物占较大比例。因此,我们选择了具有单氟、多氟以及三氟甲基取代基的苯基结构,以研究氟原子的引入以及引入氟原子的数目及集中度对其抗肿瘤活性的影响。

1.2.3 目标化合物(6a-6u)结构表征

6-苯基-1-甲基-β-咔啉(6a):合成路线见图3,白色固体,收率94.0%,mp>280 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.76 (s, 1H), 8.56 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (dd,J=8.4, 1.6 Hz, 1H), 7.80 (d,J=7.6 Hz, 2H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.52 (t,J=7.6 Hz, 2H), 7.36 (t,J=7.2 Hz, 1H), 2.80 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 142.40, 141.26, 140.58, 137.26, 135.39, 132.31, 129.38, 128.06, 127.76, 127.20, 127.13, 122.14, 120.37, 113.60, 112.86, 20.51; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C18H15N2[M+H]+259.122 9, found 259.123 0。

6-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-β-咔啉(6b):白色固体,收率78.0%,mp>280 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.56 (s, 1H), 8.48 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.20 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.00 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.80 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.76～7.68 (m, 2H), 7.64 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.12～7.00 (m, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.76 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 158.80, 142.62, 139.94, 137.95, 135.42, 133.80, 131.93, 128.22, 127.58, 127.17, 122.22, 119.57, 114.81, 113.33, 112.70, 55.63, 20.88; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H17N2O [M+H]+289.133 5, found 289.133 8。

6-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1-甲基-β-咔啉(6c):白色固体,收率87.9%,mp 241.6～243.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.92 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.28 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.00～7.84 (m, 3H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.48 (d,J=8.0 Hz, 2H), 2.84 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.82, 142.15, 141.02, 140.56, 136.46, 135.35, 131.00, 128.96, 128.52, 128.10, 122.01, 121.95, 120.86, 119.37 (q,J= 254.6 Hz), 113.87, 113.06, 20.06; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14F3N2O [M+H]+343.105 2, found 343.105 5。

6-(4-氟苯基)-1-甲基-1-甲基-β-咔啉(6d):白色固体,收率89.1%,mp 264.0～265.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.64 (s, 1H), 8.52 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.00 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.84～7.78 (m, 3H), 7.68 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.32 (t,J=8.8 Hz, 2H), 2.78 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.69 (d,J=241.8 Hz), 142.73, 140.24, 138.12, 137.84 (d,J=2.9 Hz), 135.46, 131.11, 129.07 (d,J=7.9 Hz), 127.54, 127.36, 122.24, 120.24, 116.20 (d,J=21.1 Hz), 113.34, 112.79, 20.91; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C18H14FN2[M+H]+277.113 5, found 277.113 6。

6-(4-(三氟甲基)苯基)-1-甲基-β-咔啉(6e):白色固体,收率86.7%,mp 258.0～259.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.76 (s, 1H), 8.68 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.02 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.92 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.84 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 2.80 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.29 (q,J=1.0 Hz), 142.72, 140.94, 137.96, 135.48, 130.38, 127.76, 127.61, 127.27 (q,J=31.8 Hz), 126.23 (q,J=3.8 Hz), 124.99 (q,J=270.1 Hz), 122.28, 120.98, 113.49, 113.03, 20.75; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14F3N2[M+H]+327.110 3, found 327.110 4。

6-(3,4,5-三氟苯基)-1-甲基-β-咔啉(6f):白色固体,收率96.0%,mp 259.7～261.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.72 (s, 1H), 8.64 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.00 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.80 (d,J=6.4 Hz, 1H), 7.76 (d,J=6.8 Hz, 1H), 7.64 (d,J=8.8 Hz, 1H), 2.76 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 152.39 (m), 142.83, 140.82, 139.36 (dd,J=246.5, 15.4 Hz), 138.23, 135.51, 131.89 (dd,J=272.4, 9.8 Hz), 128.63, 127.60, 127.18, 122.22, 120.83, 113.35, 112.82, 111.39(m), 20.85; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C18H12F3N2[M+H]+313.094 7, found 313.094 5。

6-(4-(甲腈基)苯基)-1-甲基-β-咔啉(6g):白色固体,收率90.5%,mp>280 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.80 (s, 1H), 8.72 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.04～8.00 (m, 2H), 7.96～7.92 (m, 3H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 2.80 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.76, 142.70, 141.15, 137.87, 135.48, 133.27, 130.01, 127.88, 127.79, 127.61, 122.29, 121.19, 119.55, 113.55, 113.08, 109.47, 20.67; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14N3[M+H]+284.118 2, found 284.118 2。

6-苯基-1,9-二甲基-β-咔啉(6h):白色固体,收率91.0%,mp 154.1～155.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.84～7.76 (m, 3H), 7.52 (t,J=7.6 Hz, 2H), 7.36～7.32 (m, 1H), 4.16 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 142.54, 141.63, 141.07, 137.97, 136.17, 132.14, 129.38, 128.38, 127.53, 127.18, 127.15, 121.41, 119.88, 113.60, 111.07, 32.63, 23.68; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H17N2[M+H]+273.138 6, found 273.138 7。

6-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6i):白色固体,收率75.5%,mp 189.6～190.6 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.48 (s, 1H), 8.20 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.76～7.68 (m, 3H), 7.08 (d,J=8.8 Hz, 2H), 4.16 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 158.85, 142.49, 141.27, 137.87, 136.14, 133.52, 131.97, 128.34, 128.22, 127.25, 121.39, 119.21, 114.82, 113.58, 110.99, 55.64, 32.62, 23.68; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H19N2O [M+H]+303.149 1, found 303.149 2。

6-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6j):白色固体,收率80.5%,mp 146.7～147.9 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.60 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.96～7.88 (m, 3H), 7.80 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.48 (d,J=8.0 Hz, 2H), 4.20 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.79, 147.77, 142.63, 141.79, 140.47, 138.06, 136.20, 130.62, 128.92, 128.34, 127.53, 121.94, 121.42, 120.21, 119.38 (q,J= 254.7 Hz), 113.60, 111.20, 32.66, 23.67; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H16F3N2O [M+H]+357.120 9, found 357.120 6。

6-(4-氟苯基)-1-甲基-1,9-二甲基-β-咔啉(6k):白色固体,收率86.9%,mp 146.1～147.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=1.2 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.88～7.80 (m, 2H), 7.76 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.36～7.28 (m, 2H), 4.16 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.73 (d,J=241.9 Hz), 142.58, 141.56, 137.99 (d,J=3.0 Hz), 137.58, 136.18, 131.13, 129.08 (d,J=7.9 Hz), 128.33, 127.46, 121.39, 119.87, 116.22 (d,J=21.1 Hz), 113.59, 111.10, 32.64, 23.69; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H16FN2[M+H]+291.129 2, found 291.129 2。

6-(4-(三氟甲基)苯基)1,9-二甲基-β-咔啉(6l):白色固体,收率83.2%,mp 139.2～141.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.68 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04～7.96 (m, 3H), 7.84 (dd,J=8.4, 5.2 Hz, 3H), 4.20 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.04, 142.67, 142.12, 138.09, 136.22, 130.31, 128.40, 127.74, 127.62, 127.31 (q,J=31.7 Hz), 126.21 (q,J=3.9 Hz), 123.64 (q,J=270.1 Hz), 121.46, 120.55, 113.65, 111.31, 32.68, 23.62; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H16F3N2[M+H]+341.126 0, found 341.126 0。

6-(3,4,5-三氟苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6m):白色固体,收率94.2%,mp 160.4～161.1 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.40～8.16 (m, 2H), 7.92 (d,J=4.8 Hz, 1H), 7.76 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.52 (d,J=8.6 Hz, 1H), 7.36～7.20 (m, 3H), 4.20 (s, 3H), 3.12 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 152.79, 150.35 (m), 142.04 (d,J=19.9 Hz), 137.78, 136.40, 130.26, 129.10, 127.43, 121.62, 119.86, 113.24, 111.04 (dd,J=15.9, 5.9 Hz), 110.16, 32.55, 23.11; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14F3N2[M+H]+327.110 3, found 327.110 2。

6-(4-(甲腈基)苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6n):白色固体,收率89.9%,mp 213.3～214.6 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04～8.00 (m, 3H), 7.96～7.92 (m, 2H), 7.80 (d,J=8.4 Hz, 1H), 4.16 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.51, 142.71, 142.25, 138.19, 136.23, 133.26, 129.87, 128.40, 127.75, 127.54, 121.49, 120.71, 119.56, 113.65, 111.35, 109.48, 32.69, 23.63; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H16N3[M+H]+298.133 8, found 298.133 8。

6-苯基-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-β-咔啉(6o):白色固体,收率92.8%,mp 156.2～156.8 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.60 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=4.8 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.80～7.76 (m, 2H), 7.68 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.52～7.48 (m, 2H), 7.40～7.32 (m, 1H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 146.30 (m), 143.88 (m), 142.20, 141.07, 140.84, 138.87, 136.35 (m), 135.88, 133.12, 129.39, 129.22, 127.90, 127.32, 127.24, 122.13, 120.12, 113.81, 112.29 (m), 111.04, 38.89, 23.56; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C25H16F5N2[M+H]+439.122 8, found 439.122 9。

6-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-β-咔啉(6p):白色固体,收率81.3%,mp 154.5～155.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.52 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 2H), 7.64 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.04 (d,J= 8.8 Hz, 2H), 6.12 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.46, 158.97, 146.34 (m), 143.83 (m), 142.15, 140.65, 138.77, 136.29 (m), 135.86, 133.25, 132.91, 131.94, 129.17, 128.27, 127.58, 122.11, 119.43, 114.83, 113.77, 112.30 (m), 110.93, 55.63, 23.57, 21.52; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H18F5N2O [M+H]+469.133 3, found 469.133 4。

6-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-β-咔啉(6q):白色固体,收率87.8%,mp 162.8～163.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.64 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.96～7.88 (m, 3H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.48 (d,J=8.4 Hz, 2H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.91, 146.22 (m), 143.85 (m), 142.26, 141.28, 140.23, 138.90, 136.35 (m), 135.90, 131.62, 129.20, 129.02, 127.93, 122.12, 121.95, 120.46, 119.36 (q,J=254.6 Hz), 113.81, 112.23 (m), 111.16, 38.92, 23.51; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H15F8N2O [M+H]+523.105 1, found 523.105 5。

6-(4-氟苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-β-咔啉(6r):白色固体,收率90.4%,mp 164.4～165.8 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.60 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.84～7.80 (m, 2H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.64～7.60 (m, 1H), 7.36～7.28 (m, 2H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.83 (d,J=242.2 Hz), 146.30 (m), 143.86 (m), 142.21, 141.01, 138.85, 137.31 (d,J=3.2 Hz), 136.34 (m), 135.88, 132.10, 131.99, 131.89, 129.20 (d,J=6.7 Hz), 129.15, 129.07, 127.84, 122.11, 120.11, 116.03 (d,J=21.1 Hz), 113.80, 112.24 (m), 111.05, 38.88, 23.52; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C25H15F6N2[M+H]+457.113 3, found 457.113 3。

6-(4-(三氟甲基)苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-β-咔啉(6s):白色固体,收率89.7%,mp 150.6～152.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.96 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.84 (d,J=8.2 Hz, 2H), 7.72～7.64 (m, 1H), 7.60～7.52 (m, 1H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 146.27 (m), 144.81, 143.84 (m), 142.33, 141.60, 139.04, 138.83 (m), 136.35 (m), 135.93, 131.99, 131.89, 131.30, 129.20, 127.98, 127.82, 127.50 (q,J=31.6 Hz), 126.23 (q,J=3.7 Hz), 123.60 (q,J=270 Hz), 122.19, 120.75, 113.83, 112.22 (m), 111.27, 38.93, 23.52; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H15F8N2[M+H]+507.110 2, found 507.110 0。

6-(3,4,5-三氟苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-β-咔啉(6t):白色固体,收率93.7%,mp 190.8～191.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72 (s, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.96 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.84～7.80 (m, 2H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 152.36 (dd,J=9.8, 4.2 Hz), 149.86 (dd,J=9.9, 4.3 Hz), 146.25 (m), 143.80 (m), 142.36, 141.62, 139.07, 137.66 (m), 137.05, 136.35 (m), 135.94, 133.72, 132.70, 132.49 (d,J=2.8 Hz), 131.99 (d,J=9.6 Hz), 129.56, 129.27 (d,J=11.6 Hz), 129.20, 129.15, 127.65, 122.08, 120.62, 113.77, 112.24 (m), 111.45 (dd,J=16.0, 5.4 Hz), 111.16, 38.95, 23.46; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C25H13F8N2[M+H]+493.094 5, found 493.094 7。

6-(4-(甲腈基)苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟苄基)-β-咔啉(6u):白色固体,收率91.6%,mp 235.1～236.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.76 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04～8.00 (m, 2H), 7.96～7.92 (m, 2H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.64～7.60 (m, 1H), 6.16 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.30, 142.36, 141.80, 139.08, 135.94, 133.30, 132.49 (d,J=2.7 Hz), 131.94 (d,J=9.8 Hz), 130.92, 129.26 (d,J=3.0 Hz), 129.16, 127.98, 127.88, 122.21, 120.95, 119.50, 113.87, 111.36, 109.74, 61.20, 29.67, 23.49; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H15F5N3[M+H]+464.118 0, found 464.118 2。

1.3 生物活性测试

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测试了目标化合物对肿瘤细胞株的抑制活性。为增加目标化合物的水溶性,在测试前将化合物制备为盐酸盐形式。实验方法:分别将细胞株以1×104mL-1的浓度接种于96孔板,置于37 ℃的CO2培养箱中培养24 h,使其处于对数生长期。换新鲜培养液,加入灭菌处理的不同浓度梯度的待测样品,继续培养48 h,每个梯度平行测试3次。以等体积的样品试剂作为空白对照。每孔加入含5 mg·mL-1MTT的RPMI-1640培养液20 μL,继续培养4 h。小心除去上清液,每孔加入DMSO为100 μL,振荡溶解沉淀,大约10 min后,用酶标仪检测OD值,波长490 nm。重复实验两次,计算出各浓度测试样品的细胞存活率,以细胞存活率对药物浓度对数作图,按作图法求出每个样品的IC50值[25]。

细胞存活率的计算公式如下:

细胞存活率 (%)=(样品组平均OD值)×(对照组平均OD值)-1×100%。

1.4 分子对接

采用Open Eye软件进行分子对接模拟。使用的蛋白晶体结构为VEGFR-2蛋白(ID: 4AGD)、PDGFR-α蛋白(ID: 6JOK)和KIT激酶蛋白(ID: 7KHG),对晶体结构进行去水分、加氢、添加部分电荷及能量最小化处理,并根据参照配体位置和目标化合物性质选定活性口袋位置及大小;采用ChemBioDraw Ultra 14.0 画出目标化合物的结构,使用MMFF94力场进行优化,并输出为mol2格式,随后使用Omega组件进行构象优化,Rocs组件进行形状相似性虚拟筛选,使用Oedcocking组件进行分子对接,并用Vida组件观察其对接情况,进行结果分析。

2 结果与讨论

2.1 化合物的合成

将L-色氨酸与乙醛在稀硫酸水溶液中发生Pictet-Spengler环化反应得到化合物2,之后通过活性MnO2氧化得到1-甲基-β-咔啉(3)。以N-溴代丁二酰亚胺(NBS)为溴化试剂在其C6位引入溴原子得到中间体4。之后,在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中与碘甲烷或2,3,4,5,6-五氟溴苄发生N9-烷基化反应,获得关键中间体5a、5b。最后将中间体4、5a和5b与7种苯硼酸化合物发生Suzuki偶联得到21种新型6-取代-β-咔啉衍生物(6a-6u),产率为75%～96%。目标化合物均经1H NMR、13C NMR和HRMS确证结构。

2.2 体外抗肿瘤活性测定

为了初步评价目标化合物6a-6u的体外抗肿瘤活性,以肺癌细胞A549、胃癌细胞BGC-823、结肠癌细胞CT-26、肝癌细胞Bel-7402、乳腺癌细胞MCF-7等5种肿瘤细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法对合成的21个目标化合物进行了体外抗肿瘤活性研究,并选取顺铂(DDP)作为阳性对照药。结果如表2所示。

表2 目标化合物对5种肿瘤细胞株的抑制活性

体外活性实验表明,大部分目标化合物均表现出中等程度体外抗肿瘤活性,其中化合物6c、6l-6n对A549细胞系表现出较好的体外抑制活性,其IC50值分别为6.6±0.4 μmol·L-1、9.4±0.4 μmol·L-1、7.7±0.3 μmol·L-1和8.2±0.4 μmol·L-1。化合物6m、6t对BGC-823具有较好的体外抑制活性,其IC50值均低于10 μmol·L-1,且优于阳性对照药物顺铂。对于CT-26,化合物6d具有最优的体外抑制活性,其IC50值为4.9±0.1 μmol·L-1,略优于顺铂的5.4±0.1 μmol·L-1。而6c、6h和6k等5个化合物的IC50值也低于10 μmol·L-1,显示出较好的体外抑制活性。对于Bel-7402和MCF-7,整个系列化合物大多显示出较低的体外抑制活性,所有化合物中只有4个化合物的IC50值低于20 μmol·L-1,其中化合物6t对Bel-7402细胞系的体外抑制活性最优为3.9±0.1 μmol·L-1,而化合物6n对MCF-7细胞系的体外抑制活性最优为3.4±0.1 μmol·L-1,均优于阳性对照药物。

初步分析化合物对肿瘤细胞体外抑制活性构效关系发现,在β-咔啉的C6位引入具有吸电子取代基的苯基(如3,4,5-三氟苯基,6-氰基苯基)有助于提高其抗肿瘤活性;而在β-咔啉N9位引入取代基替代原位的氢原子可增强其对多种癌细胞的抑制活性。

2.3 分子对接研究

为进一步探寻目标化合物各部分结构对抗肿瘤活性的影响,我们对目标化合物进行了分子对接研究。经文献检索发现β-咔啉化合物抗肿瘤活性与血管内皮生长因子受体VEGFR-2,血小板源性生长因子受体α (PDGFR-α)和KIT络氨酸激酶[26]有关。采用Open Eye模拟软件的Docking组件实现了目标化合物与VEGFR-2,PDGFR-α等蛋白的分子对接。所需的VEGFR-2蛋白(ID: 4AGD)、PDGFR-α蛋白(ID: 6JOK)和KIT激酶蛋白(ID: 7KHG)等从RCSB蛋白质数据库获得。使用默认参数设置,对目标化合物进行了分子对接研究,对接结果如表3所示。

表3 目标化合物对3种靶点的分子对接打分

通过化合物与蛋白分子对接研究,获得了目标化合物与6JOK、7KHG等蛋白的结合特征。对接结果显示多数化合物对7KHG靶点蛋白表现出良好的结合能力(对接评分<-10)且优于4AGD、6JOK。我们以在活性实验及分子对接中均表现较为优异的化合物6n为例分析其与靶点6JOK、7KHG的结合情况。如图4所示。化合物6n位于一个由Val-607、Val-658、Lys-627、Asp-681和Asn-684等氨基酸残基所组成的疏水性腔袋中,形成较为强烈的疏水性相互作用;化合物6n的苯环可以与Phe-837的苯环形成 π-π 相互作用。此相互作用使得6n与6JOK的结合具有一定的稳定性,但化合物分子没有被很好的包裹于空腔中。

图4 化合物6n与6JOK的分子对接模拟图

化合物6n与7KHG的结合模式如图5所示。化合物6n位于由Gly-676、Cys-674、Glu-671、Thr-670、Ile-669和Val-668等组成的疏水性腔袋中,能够形成强烈的疏水相互作用。6n的吲哚苯环可以与氨基酸残基Phe-811的苯环形成 π-π 相互作用,且整个分子可完美的包裹于空腔中。

图5 化合物6n与7KHG的分子对接模拟图

对比化合物6n在两种蛋白中的结合情况,我们发现在C6位引入芳基可增强其与靶点蛋白的结合,从而在抗肿瘤活性中发挥积极作用。

3 结论

为了寻找具有良好活性的抗肿瘤先导化合物,本文对1-甲基-β-咔啉的C6位进行结构修饰共得到21个新型6-取代-β-咔啉衍生物,采用MTT法测试了目标化合物 (6a-6u) 对A549、BGC-823、CT-26、Bel-7402和MCF-7的抗肿瘤活性。活性数据分析表明:大部分化合物对所测试肿瘤细胞系表现出一定的体外抗肿瘤活性(IC50<40 μmol·L-1),其中化合物6c、6l-6n和6t分别对两种肿瘤细胞系显示出良好活性,IC50值均小于10 μmol·L-1。同时,我们对目标化合物进行了分子对接,测试了它们对VEGFR-2,PDGFR-α等蛋白的结合能力,分子对接结果表明:目标化合物对7KHG靶点具有较优的综合评分,且结合趋势与体外抗肿瘤活性实验结果相印证,在其C6位引入芳基可增强其与靶点蛋白的结合,在抗肿瘤活性中发挥积极作用。构效关系结果表明:在β-咔啉的C6位引入具有吸电子取代基的芳基(如3, 4, 5-三氟苯基, 6-氰基苯基)表现出较高抗胃癌细胞活性;β-咔啉N9位引入取代基替代原位的氢原子对多种癌细胞表现出较高抗肿瘤活性。