赤霉素和氯吡脲的体外细胞及致突变毒性研究

图尔逊娜依·艾力,吴军强,雒怡倩,王潇,杨洁,岳海涛

(新疆大学生命科学与技术学院,新疆 乌鲁木齐 830046)

植物生长调节剂(plant growth regulator, PGR)是人工合成的对植物生长发育有调节作用的化学物质,具有促进坐果、增加产量、提高果实品质、改变果蔬品相等重要作用[1],在农业生产领域具有巨大增产潜力和可观的经济效益。截至2022年3月,我国共有有效期内植物生长调节剂登记产品1 375个,登记作物涉及红枣、葡萄、油菜、番茄、小麦、水稻等70余种。与传统农业技术相比,植物生长调节剂的应用具有毒性低、成本低、收效快、效益高等优点[2]。氯吡脲和赤霉酸是2种在葡萄、红枣、西瓜、猕猴桃等植物中广泛使用的植物生长调节剂,通过调节作物内各种内源激素水平来促进生长,或通过直接调节酶活性从而调控植株的生理生化过程来促进细胞分裂、果实膨大,提高坐果率,改善品相。

赤霉素(gibberellin,GA,C19H22O6)是四环双帖类结构的植物生长调节物质,调控着植物许多重要生长和发育过程[3],赤霉素目前已在小麦、葡萄、黄瓜等40种农作物登记使用,在果蔬种植环节中普遍用于膨大果实、促进生长等,市面上以赤霉素为主要成分的产品有200余种[4]。虽然国内外针对植物生长调节的最大残留限量值都制定了严格的限制标准,但我国将赤霉酸列为豁免物质之一,而日本制定各类果蔬中赤霉素最大残留限量值范围为0.05～2.00 mg·kg-1[5]。

氯吡脲(forchlorfenuron,CPPU,C12H10ClN3O)属于苯脲类细胞分裂素,具有促进细胞分裂、增大细胞体积、提高光合作用效率等生理功能[6],从而可以起到促进果实增产、提高品质等作用,目前已登记的氯吡脲成分产品有34种,使用于西瓜、葡萄、黄瓜等10种作物,氯吡脲常见残留限量是0.05～0.10 mg·kg-1[4]。

在我国赤霉素和氯吡脲等植物生长调节剂归于农药类进行统一管理,由于植物生长调节剂是一类调节植物生长发育的激素类物质,且在成熟的瓜果蔬菜中残留量较低,在烹饪或加工过程中也会遭到不同程度的破坏,所以,其毒性一般定义为低毒或微毒。但是植物生长调节剂同其他合成农药一样,盲目地使用会造成食品、环境中的高残留,引起人畜的急、慢性中毒,导致疾病的发生[7]。根据相关研究报道,GA引起肿瘤发育[8-9],降低肝脏的抗氧化防御功能,损伤其组织结构和生化功能[10]。滥用氯吡脲等植物激素增加蔬果产量和美化蔬果外观带来的食品安全问题逐渐受到了社会的关注[11]。有研究表明,氯吡脲对鹌鹑经口急性毒性LD50>2 250 mg·kg-1,LC50>5 260 mg·kg-1;对鱼类、水蚤和羊角月牙藻有中等毒性;对无脊椎动物影响较小。CPPU对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖、迁移和管状结构的形成具有抑制作用[13]。现有的赤霉素和氯吡脲体外细胞毒性进而致突变毒性研究较少,大量的动物实验结果显示赤霉素和氯吡脲具有肝毒性[14-15],因此赤霉素和氯吡脲的体外安全性值得关注。

近年来,随着人们安全意识的提高,对赤霉素和氯吡脲是否存在潜在的危害成了消费者关注话题,阐明其产生的毒性是否对人体健康造成危害是非常有必要的。本研究利用人正常肝细胞(WRL68)对赤霉素和氯吡脲在细胞水平的毒性做初步探究,通过小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)TK基因突变试验、鼠伤寒沙门氏菌Ames试验对赤霉素和氯吡脲致突变性进行评价,以期能够为赤霉素、氯吡脲等植物生长调节剂的规范使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要试剂

胎牛血清、马血清:以色列生物科技公司;青霉素-链霉素双抗、MEM培养基、磷酸缓冲盐溶液(pH7.2)、0.25%胰蛋白酶、丙酮酸钠:美国Hyclone公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜、三氟胸苷、甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷、氨甲喋呤、甲磺酸甲酯、辅酶II(NADP)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P):美国Sigma公司;台盼蓝、氨苄青霉素、四环素、赤霉素、氯吡脲:生工生物工程(上海)股份有限公司;S9:美国MOLTOX公司;RPMI1640培养基:美国 Gibco 公司;L-组氨酸、D-生物素、琼脂粉、磷酸氢二钾、磷酸氢铵钠:上海源叶生物科技有限公司;氯化钠、牛肉膏、葡萄糖、胰蛋白胨:北京化工有限公司。

1.1.2 主要仪器

试验所用仪器设备情况见表1。

表1 仪器与设备

1.2 实验方法

人正常肝细胞(WRL68)由新疆大学生物资源基因工程重点实验室提供;小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;鼠伤寒沙门氏菌购自美国MOLTOX公司。

1.2.1 WRL68细胞培养

WRL68细胞培养于10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的MEM培养基中,在37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。待细胞生长至70%～80%后加入胰酶消化,消化后将细胞稀释制成1×105个·mL-1的细胞悬液,150 μL·孔-1接种于96板中,待其贴壁后,弃上清,将GA和CPPU用培养基稀释成不同浓度的GA(0.25 mg·mL-1,0.5 mg·mL-1,1 mg·mL-1,1.5 mg·mL-1,2 mg·mL-1,2.5 mg·mL-1,3 mg·mL-1,3.5 mg·mL-1,4 mg·mL-1,4.56 mg·mL-1)和CPPU(0.19 μg·mL-1、0.375 μg·mL-1、0.75 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、3 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1,12.5 μg·mL-1,25 μg·mL-1,50 μg·mL-1,100 μg·mL-1),每孔加入150 μL进行24 h染毒。实验结束后,弃去上清液,每孔加入20 μL MTT(终浓度为5 mg·mL-1)培养4 h,后加200 μL DMSO溶解结晶颗粒(另设6个空白孔),于490 nm波长处测定OD值。细胞存活率的计算参考侯志梅等[16]的方法。

1.2.2 小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)培养

在进行细胞系培养时,需要的培养液有RPMI-5、RPMI-10和RPMI-20。以上各培养液所用马血清均经56 ℃灭活,并在每毫升培养基中添加200 μg丙酮酸,和1%的青-链霉素。

THMG和THG的配制参考《GB 15193.20-2014食品安全国家标准体外哺乳类细胞TK基因突变试验(标准状态:现行)》的标准。分别将THMG和THG配成100倍浓度母液,滤膜过滤除菌后分装,-20 ℃备用。

1.2.3 小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)突变频率测定

首先用RPMI-5调整细胞密度为 5×105个·mL-1,每组取20 mL加入50 mL塑料离心管中。按1%体积加入赤霉素和氯吡脲,另设溶剂对照(DMSO)、空白对照组,振摇处理3 h(振荡频率为70次·min-1)。处理结束后,离心(1 000 rpm,5 min),弃上清,用PBS洗涤细胞1次,重新悬浮于RPMI-10中,并调整细胞密度到2×105个·mL-1。

将处理后的L5178Y细胞,用RPMI-20梯度稀释至8个·mL-1,每组25 mL(对照组为50 mL)。用八通道加样枪以200 μL·孔-1接种1块96孔培养板。置于5% CO2、37 ℃ 饱和湿度培养箱内培养12 d,计数每块培养板有集落生长的孔数,记为PE0。随后将剩余的L5178Y细胞表达培养2 d。每天计数细胞密度,调整细胞密度到2×105个·mL-1,并计算每日细胞增长率(DCG),据此求算两天内相对悬浮增长率(RSG)。取一定量细胞梯度稀释后接种96孔板,测定PE2。表达培养结束后,取适量细胞,用RPMI-20培养液调整密度至1×104个·mL-1,每组50 mL(阴性对照为100 mL),加入三氟胸苷(TFT),使其终浓度为3 μg·mL-1。以200 μL·孔-1(2 000个细胞/孔)接种2块96孔培养板(对照接种4块),置于5%CO2、37 ℃饱和湿度培养箱内培养12 d,计数各培养板有集落生长的孔数。平板接种效率和突变频率、细胞毒性指标和小集落百分数(%SC)的计算参考《GB/T 15670.20-2017 农药登记毒理学实验方法第20部分:体外哺乳动物细胞基因突变实验》[17]中的方法。

1.2.4 鼠伤寒沙门氏菌的培养

所用培养基有顶层琼脂培养基、Vogel-Bonner (V-B)培养基、底层琼脂培养基和营养肉汤培养基,培养基的配制参考何珍等[18]的方法。经30 ℃培养后,鉴定合格的菌种放在加入1.5 mL的9%色谱级二甲基亚砜作为冷冻保护剂的超低温(-80 ℃)冰箱中保存。

2 结果与分析

2.1 赤霉素和氯吡脲对WRL68细胞增殖的影响

通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测GA和CPPU对WRL68细胞增殖的影响,结果如图1所示。利用不同浓度的GA(0.25 mg·mL-1,0.5 mg·mL-1,1 mg·mL-1,1.5 mg·mL-1,2 mg·mL-1,2.5 mg·mL-1,3 mg·mL-1,3.5 mg·mL-1,4 mg·mL-1,4.56 mg·mL-1)对WRL68细胞暴露24 h后,MTT结果显示随着赤霉素浓度逐渐增加WRL68细胞存活率呈下降趋势,存在明显剂量依赖性。GA对WRL68细胞的半数抑制浓度为1.377 mg·mL-1,赤霉素浓度大于3 mg·mL-1时明显抑制了WRL68细胞增长(图1a)。

图1 GA(a)和CPPU(b)对WRL68细胞增殖的影响

不同浓度的CPPU(0.19 μg·mL-1、0.375 μg·mL-1、0.75 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、3 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1,12.5 μg·mL-1,25 μg·mL-1,50 μg·mL-1,100 μg·mL-1)对WRL68染毒24 h后,MTT结果显示WRL68细胞存活率随着浓度的升高有下降的趋势。氯吡脲对WRL68细胞的半数抑制浓度为57.72 μg·mL-1,浓度大于100 μg·mL-1时明显抑制了WRL68细胞增长(图1b)。

根据MTT实验中得出的IC50结果,选取IC50上下两个浓度进行24 h染毒处理。随机选取显微镜下不同视野拍照,观察细胞形态,将24孔板原有的培养基弃掉,加入100 μL·孔-10.5%台盼蓝染液,静置5 min后,观察细胞凋亡情况,结果如图2所示。

图2 GA和CPPU对WRL68细胞形态及凋亡的影响(200×)

高剂量组的受试物可使WRL68细胞的正常形态发生改变,细胞皱缩;染毒后细胞数量较对照组也明显减少,在中剂量和低剂量组有不同程度的细胞凋亡和皱缩;高、中、低剂量组存活的细胞密度与药物剂量呈相关性,随着剂量越高细胞凋亡越严重。药物对WRL68细胞产生毒性从而导致细胞凋亡,使细胞皱缩,形态改变,甚至细胞数量减少,这与MTT实验结果相一致。

2.2 赤霉素、氯吡脲对小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)TK基因突变的影响

小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)TK基因突变试验结果如表2和表3所示,因是短期试验所以需进行活化系统(+S9)(表2)和非活化系统(-S9)(表3)两种试验条件。

表2 TK基因突变测定(无活化系统)

表3 TK基因突变测定(活化系统)

结果发现,随着赤霉素、氯吡脲剂量增加,TK基因突变频率增加,赤霉素、氯吡脲诱发的突变频率与自发突变率相比未呈现2倍以上的倍数关系。在无活化系统实验条件下,赤霉素1.6 mg·mL-1、1.3 mg·mL-1、1 mg·mL-1剂量组与自发突变率相比呈1.78倍、1.52倍、1.07倍关系;在活化系统中分别是1.4倍、1.36倍、1.19倍。氯吡脲100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1剂量组与自发突变率相比呈1.89倍、1.09倍、1.01倍关系;在活化系统中分别是1.50倍、1.38倍、1.14倍。这就说明赤霉素、氯吡脲在设计的剂量范围内对L5178Y细胞TK基因无致突变毒性。

2.3 赤霉素、氯吡脲对细菌回复突变的影响

测试菌株的回变特性主要是检验菌株的敏感性,操作步骤与正式实验相同,菌株生物学特性鉴定结果如表4所示,菌株生物学特性鉴定结果符合标准规范要求。部分致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变,故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9 混合液。

表4 菌株回变特性鉴定结果

Ames试验结果如表5和表6所示。氯吡脲和赤霉素在测试范围内,无论是否有代谢活化系统存在(S9),各菌株的平均回变菌落数均小于阴性对照组的2倍,说明氯吡脲和赤霉素对鼠伤寒沙门氏菌无致突变性。这进一步表明氯吡脲和赤霉素无致突变毒性。

表5 TA97a 菌株回复突变情况

表6 TA102 菌株回复突变情况

3 讨论与结论

3.1 讨论

GA和CPPU是生物活性最强的植物生长调节剂,在促进果实无核方面效果显著,同时具有促进葡萄等果实膨大的作用[3,5]。在合理的剂量和使用频次范围内使用GA和CPPU,可以促进水果果实的膨大和无核化,可以有效提高果品的产量和质量。然而,由于过量使用GA和CPPU,对果实的安全性带来潜在的风险尚不明确。关于GA、CPPU的细胞毒性目前研究较少,现有的研究主要是CPPU对心肌细胞(H9c2)、人体静脉内皮细胞(HUVECs)[13]的影响。肝细胞具有多种功能且代谢旺盛,对外源污染物反应灵敏,离体培养的人肝细胞常用于毒理学、药理学、生物化学及致癌作用等研究。

肝细胞的毒性一般从细胞活性、细胞形态等方面作为参考指标进行评价[19]。因此,本研究以人肝细胞WRL68为实验对象,通过分析WRL68细胞增殖来评价膨大剂毒性。细胞存活率为毒性指标,检测GA、CPPU不同暴露浓度下对WRL68的细胞毒性。结果表明,该细胞的存活率随着GA和CPPU暴露浓度的增大而下降,说明WRL68细胞毒性与GA、CPPU的暴露浓度呈正相关。这一结果与郭毅炜等[20]研究断乳至性成熟期间持续暴露赤霉素对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响结果相一致,即GA高剂量组中有明显可见的核固缩和凋亡小体,推测膨大剂可能加速了细胞凋亡。小鼠毒性试验证明GA、CPPU对肝脏有一定的毒性,GA暴露导致小鼠肝脏脂变[8]。这也与本研究中GA和CPPU在剂量范围内不同程度抑制WRL68细胞增长的结果一致。

小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验(MLA)和细菌回复突变试验是遗传毒性试验标准组合推荐方法之一,在药物非临床安全性评价及其他领域经常被作为评价致突变毒性及遗传毒性的关键方法[21]。本研究在剂量范围内回变菌落数均未超过菌种本身自发回变落数的2倍;而阳性组回变菌落数均大于自发回变菌落数的2倍,这就说明GA和CPPU无致突变毒性。这一结果与林利美等[22]关于小鼠骨髓微核实验结果相一致。这就表明膨大剂使用在合理范围内不存在致突变毒性。

目前,GA的遗传毒性是存在争议的。本研究结果表明赤霉素对鼠伤寒沙门氏菌和小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)在设计的剂量范围内不存在遗传毒性。但商桑等[23]通过蚕豆根尖细胞微核实验、小鼠骨髓细胞微核实验证明在7.5 g·kg-1剂量下对植物细胞、动物的体细胞与生殖细胞均具有遗传毒性。这一结果与前期研究人员的研究结果出现偏差,可能的原因是所采用的遗传毒性探究方法和使用剂量不同。因此,有关赤霉素和氯吡脲的毒性效应评价还需更加全面的研究。

3.2 结论

本研究通过对两种代表性植物生长调节剂赤霉素、氯吡脲对人肝细胞(WRL68)增殖、小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y)TK基因突变以及鼠伤寒沙门氏菌回复突变的研究,得出不同浓度的赤霉素、氯吡脲暴露后均能不同程度的抑制WRL68细胞的存活,且细胞存活率随着暴露浓度增大而下降;赤霉素、氯吡脲在剂量范围内不存在致突变毒性。该结果可为后续全面评估植物生长调节剂使用带来的潜在风险性提供参考,也为农业生产上进一步规范使用提供依据。