DLBCL患者血Th22细胞、IL-22水平及IL-22对DLBCL细胞株增殖和侵袭的影响

张灵, 范凌, 郝杰, 张阳, 靳艳丽, 高炳华

河北北方学院附属第一医院血液科,河北张家口 075000

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一种来源于成熟B细胞的侵袭性肿瘤,是最常见的非霍奇金淋巴瘤,约占全部非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。DLBCL临床异质性大,发病机制和发展较复杂,具体机制尚不清楚,探究DLBCL的发病机制、寻找新的治疗靶点具有重要意义。大量研究表明免疫细胞在DLBCL发生、发展中发挥重要作用[2]。辅助性T细胞22(helper T cell 22,Th22)是最新发现的辅助性T细胞亚群,由幼稚的CD4+T细胞在白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及浆细胞样树突状细胞协同下分化而来,其主要分泌IL-22和TNF-α等细胞因子[3]。其中,IL-22是Th22细胞亚群的主要效应细胞因子。Th22细胞已被揭示在先天免疫性疾病、感染性疾病、慢性炎症性疾病及肿瘤中发挥重要作用[4],Th22细胞及其细胞因子IL-22与血液病发生、发展密切相关。然而关于Th22细胞及其分泌的细胞因子在DLBCL中作用的文献报道较少。因此,本文分析DLBCL患者血Th22细胞、IL-22水平及IL-22对DLBCL细胞株增殖和侵袭的影响,为临床提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择本院2022年1月—2022年12月收治的40例DLBCL患者(DLBCL组),男性22例,女性18例,年龄33～75岁;按照临床分期分为不同亚组,Ⅰ期7例,Ⅱ期12例,Ⅲ期13例,Ⅳ期8例。纳入标准:①符合《淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症诊断与治疗中国指南(2022年版)》[5]诊断标准;②患者及家属签署知情同意书。排除标准:①由其他淋巴瘤转化而来的、原发纵隔的、原发中枢的、原发皮肤的DLBCL,有其他恶性肿瘤史;②心脑血管、肝、肾、自身免疫性疾病及造血系统其他严重原发性疾病;③幽门螺杆菌、巨细胞病毒、乙肝病毒感染。同期选取40例体检健康成年人为对照组。两组性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经本院伦理审查委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

人淋巴细胞分离液购自美国Sigma-Aldrich公司;CD4-PerCP、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗体由eBioScience公司提供;酶联免疫试剂盒由英国Abcam公司提供;人DLBCL细胞株SU-DHL-4和TOLEDO购自中国科学院北京细胞库;胎牛血清由美国Gibco公司提供;RPMI-1640培养基由瑞士Lonza公司提供。二氧化碳细胞培养箱由上海力康公司提供;流式细胞仪由美国贝尔曼库尔特公司提供;酶标仪由美国Thermo公司提供。

1.3 流式细胞术检测Th22细胞亚群

DLBCL组新诊、化疗前后,以及复发者于来院第2日清晨空腹取外周血;对照组于体检当日取外周血。每管加入等体积PBS稀释,稀释后的血液加入到人淋巴细胞分离液中,采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,PBS冲洗并冲悬,加入CD4-PerCP、IFN-γ-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗体染色,4 ℃避光孵育30 min,采用流式细胞仪检测分析CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+(Th22)细胞占CD4+IFN-γ-T细胞的比例。

1.4 ELISA法检测IL-22水平

对照组于体检当日取外周血,DLBCL组于入院第2日清晨空腹取外周血,离心10 min取上清液。按照ELISA试剂盒说明书测定IL-22蛋白水平。

1.5 细胞培养

将人DLBCL细胞株SU-DHL-4和TOLEDO置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,37 ℃、5%CO2培养,取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.6 MTT实验检测细胞增殖

将SU-DHL-4、TOLEDO细胞分别以1×105个/孔接种于96孔板,干预组每孔加入150 μL不同质量浓度的IL-22(0、50、100、150、200 μg/L),对照组加入相同体积培养基。孵育48 h后每孔加入50 μL 0.25 g/L MTT,37 ℃孵育4 h后,加入200 μL DMSO,用酶标仪在570 nm波长处读取每孔光密度(optical density,OD)值。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭

用基质胶包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干,使用前进行基底膜水化。SU-DHL-4和TOLEDO细胞中加入200 μg/L IL-22培养48 h,对照组未经IL-22处理。随后将1×105个细胞加入上室,含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基600 μL加入下室,37 ℃、5%CO2培养24 h。显微镜下观察过膜细胞并将其用乙酸漂白染色,结晶紫洗脱,观察细胞并进行细胞计数。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 各组外周血Th22细胞比例、IL-22水平的比较

与对照组比较,DLBCL组外周血Th22细胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;图1和表1)。与临床分期Ⅰ～Ⅱ期比较,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22细胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;表1)。

表1 各组Th22细胞比例及IL-22水平的比较

图1 流式细胞术检测Th22细胞比例

2.2 化疗前后、复发和新诊DLBCL患者Th22细胞比例的比较

检测10例DLBCL患者化疗1～2个周期后外周血Th22细胞比例发现,化疗后Th22细胞比例低于化疗前(P<0.05;图2A)。检测9例复发DLBCL患者的Th22细胞比例发现,复发患者的Th22细胞比例高于新诊患者和对照组(P<0.05;图2B)。

图2 化疗前后、复发和新诊DLBCL患者Th22细胞比例的比较a为P<0.05,与治疗前或对照组比较。

2.3 IL-22对DLBCL细胞增殖的影响

IL-22作用48 h后,SU-DHL-4和TOLEDO细胞增殖OD随IL-22质量浓度的增加而增加(P<0.05;图3),这说明IL-22能促进DLBCL细胞增殖。对OD值进行线性分析(图3虚线)发现,TOLEDO细胞增长变化斜率大于SU-DHL-4细胞,提示IL-22对TOLEDO细胞的促增殖作用可能大于SU-DHL-4细胞。

图3 IL-22对DLBCL细胞增殖的影响a为P<0.05,与同细胞0、50 μg/L比较;b为P<0.05,与同细胞100 μg/L比较。

2.4 IL-22对DLBCL细胞侵袭的影响

Transwell实验结果表明,与对照组比较,IL-22组SU-DHL-4和TOLEDO细胞侵袭数目明显增加(P<0.05;表2),提示IL-22能够促进DLBCL细胞侵袭。

表2 IL-22对DLBCL细胞侵袭(细胞数目)的影响

3 讨 论

DLBCL是一组在基因学、形态学、临床特征、治疗及预后上都具有非常大异质性的侵袭性肿瘤[6]。DLBCL在中位年龄为70岁的老年患者中更为普遍,但也发生在年轻人中,很少发生在儿童中[7]。临床上,大多数患者表现为一个快速增长的肿块,涉及一个或多个淋巴结和结外部位[8]。目前,DLBCL的常规治疗方案是利妥昔单抗联合CHOP化疗,但仍有部分患者出现难治和复发的情况[9]。因此,对DLBCL发病机制的研究是必要的,这将为DLBCL的治疗提供理论基础和临床指导。

了解免疫系统如何影响肿瘤的发生和发展仍然是肿瘤学中最具挑战性的问题之一。Th22细胞被定义为CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+细胞,与已知的Th1和Th17细胞亚群比较,Th22细胞是一种新发现的独立的Th细胞亚群[10-11]。研究发现,Th22细胞在肿瘤中起着重要作用,Th22细胞能够激活肺癌JAK-STAT3/MAPK/AKT信号通路,促进肿瘤细胞增殖和迁移[12]。此外,Th22细胞也与胰腺癌、结直肠癌的不良预后有关[13-14]。本研究发现,与健康个体比较,DLBCL患者外周血Th22细胞比例显著升高,说明Th22细胞可能参与DLBCL的发生、发展。

在胃癌和宫颈癌中,Th22细胞比例增加与疾病的进展相关,并预示着较差的生存率[15-16]。本研究发现,Th22细胞比例增加与DLBCL患者较差的化疗效果相关。除此之外,本研究发现,与Ⅰ～Ⅱ期比较,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22细胞比例和IL-22水平升高。综上,外周血Th22细胞比例可作为DLBCL患者临床疗效及预后的预测因子。

为了研究IL-22对DLBCL细胞的作用,本研究进一步设计了体外实验发现,IL-22能够促进DLBCL细胞增殖和侵袭,这与文献[17]研究结果一致,文献[17]发现,胰腺癌中IL-22通过活化STAT3通路促进癌细胞增殖、迁移和侵袭。因此,IL-22在DLBCL中具有促瘤效应,而不具有抗肿瘤的免疫功能。此外,本研究发现,TOLEDO细胞比SU-DHL-4细胞对IL-22更敏感,这说明IL-22对非生发中心来源DLBCL的促瘤作用更强。阻断IL-22可作为DLBCL患者的潜在治疗靶点。

总之,DLBCL患者外周血Th22细胞比例及IL-22水平升高,Th22细胞比例与DLBCL患者临床分期及对化疗的反应有关;IL-22能够促进DLBCL细胞增殖和侵袭,提示Th22细胞及其细胞因子IL-22可能促进DLBCL的发生发展,Th22细胞可作为DLBCL患者临床疗效及预后的预测因子,本研究为临床DLBCL药物研发、治疗及预后提供新策略。