花姜酮通过抑制NLRP3炎症小体改善SAP大鼠肠道黏膜屏障功能

庄亚萍, 林志星, 钟昌会, 邓小彦

海南医学院第一附属医院重症医学科,海南海口 571101

急性胰腺炎(acute pancreastitis,AP)是胰腺及其周围组织引起的突发炎症,是腹部外科常见的急腹症之一[1]。临床上,大多数AP患者的病程呈自限性,但20%～30%患者发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),死亡率高达20%[2]。研究表明,在SAP早期阶段,肠道屏障功能障碍和炎症免疫功能紊乱是诱发和加重全身并发症的主要原因[3]。因此,维持免疫平衡,保护肠道黏膜屏障功能是阻止SAP病程加重的关键。

花姜酮是天然植物提取物,抗炎作用显著,可用于治疗动物溃疡性结肠炎以及炎症性肠病[4-5]。研究报道,花姜酮对急性胰腺炎患者原位损伤有保护作用[6],但目前尚未有涉及肠道组织的报道。本研究旨在探讨花姜酮对SAP大鼠肠道黏膜屏障功能的影响,为花姜酮应用于临床提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料

花姜酮(纯度96%)购自海南鑫禾生物工程有限公司;牛胆酸钠购自美国Sigma公司;白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒、流式细胞仪购自美国RD公司;一氧化氮(NO)试剂盒购自碧云天生物技术研究所;髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)购自南京建城生物工程研究所;分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族热蛋白结构域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、Caspase-1购自美国CA公司;荧光素(FITC)标记的羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司;显微镜购自日本OLYMPUS公司。6周龄SPF级雄性SD大鼠42只,体质量(200±20)g,由海南医学院动物实验中心提供,动物实验符合海南医学院动物伦理委员会3R标准,动物合格证号为SCXK(琼)2018-0007。

1.2 动物分组及模型建立

SD大鼠适应性喂养1周[(22±1)℃,12 h昼夜循环,自由饮水和进食],然后将其随机分为对照组、模型组、花姜酮组,每组14只。模型组和花姜酮组大鼠经胰胆管逆行注射350 mg/kg牛磺胆酸钠建立SAP模型[6],对照组大鼠经胰胆管逆行注射等量生理盐水。建模6、12 h后,花姜酮组经股静脉穿刺给与花姜酮溶液(10 mg/kg)[7],对照组和模型组给与等量蒸馏水。

1.3 HE染色检测小肠组织病理学变化

取大鼠回肠组织于10%甲醛溶液固定4 h,石蜡包埋。常规制备4 μm石蜡切片,脱蜡、脱水,采用HE染色试剂盒对切片进行染色,于显微镜下观察。

1.4 内毒素、IL-1β、TNF-α、NO及MPO含量检测

建模24 h后,取各组8只大鼠腹腔注射水合氯醛(3 mL/kg)麻醉,于腹主动脉取血,同时快速摘取小肠和肠系膜淋巴结组织。采用ELISA测定血清和小肠组织中TNF-α和IL-1β含量。采用Griess法测定血清NO水平。采用偶氮基质显色法测定血清内毒素(endotoxin,ET)含量。采用胶乳增强免疫比浊法测定小肠组织MPO含量。

1.5 EB染色检测肠道血管通透性

取各组6只大鼠于处死前30 min,经尾静脉注入30 mg/kg EB溶液。处死后,取回肠组织200 mg放入试管中,加3 mL甲酰胺反应24 h后,过滤。采用分光光度计测定滤液620 nm处光密度值,并根据EB标准曲线计算EB含量。

1.6 免疫荧光法检测NLRP3、ASC阳性细胞数

处死大鼠,快速摘取小肠和肠系膜淋巴结组织,置于10%甲醛溶液中进行石蜡包埋。取小肠组织和肠系膜淋巴结组织的石蜡切片,置于65 ℃烘箱中烤片2 h,二甲苯浸泡脱蜡,乙醇梯度水化。PBS洗涤,加0.2 mL 3%H2O2去掉内源性过氧化物酶。PBS洗涤,加pH 6柠檬酸溶液,95 ℃煮沸20 min,冷却至室温。PBS洗涤,加3%TritonX-100,5%BSA封闭30 min。加NLRP3、ASC一抗(1∶50)4 ℃过夜。次日将切片加热1 h,滴加荧光二抗(1∶100),37 ℃避光孵育30 min,PBS洗涤,甘油封片。每张切片于光镜下选取8个视野,统计NLRP3、ASC阳性细胞数量。

1.7 免疫组织化学染色法测定sIgA、Casepase-1蛋白表达水平

取小肠组织和肠系膜淋巴结组织的石蜡切片,脱蜡、水化及去掉内源性酶后,加sIgA、Casepase-1一抗(1∶50)4 ℃过夜。次日将切片加热1 h,滴加二抗(1∶500),37 ℃孵育20 min,PBS洗涤。DAB显色,HE复染,乙醇脱水,二甲苯透明10 min,中性树胶封片,光镜下观察细胞质或细胞核呈棕红色者为阳性细胞。

1.8 统计学分析

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。组间两两比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 花姜酮对大鼠小肠组织病理学影响

对照组大鼠肠壁细胞排列整齐,形态和结构完整,组织间隙无明显渗出;模型组大鼠肠组织结构紊乱,肠壁充血、水肿,有大量炎症细胞浸润,黏膜上皮细胞坏死;花姜酮组大鼠肠组织有少量炎症细胞浸润,但组织充血、水肿程度较模型组减轻(图1)。

图1 花姜酮对大鼠小肠组织病理学影响(HE染色,200×)

2.2 花姜酮对血清ET、IL-1β、TNF-α、NO及小肠组织IL-1β、TNF-α、MPO的影响

模型组大鼠血清ET、IL-1β、TNF-α、NO水平及小肠组织IL-1β、TNF-α、MPO水平较对照组升高(P<0.05)。花姜酮组大鼠血清ET、IL-1β、TNF-α、NO水平及小肠组织IL-1β、TNF-α、MPO水平较模型组均降低(P<0.05;表1)。

表1 各组大鼠血清ET、IL-1β、TNF-α、NO及小肠组织IL-1β、TNF-α、MPO水平比较(n=8)

2.3 花姜酮对肠道血管通透性的影响

模型组大鼠小肠组织EB含量较对照组升高(P<0.05);花姜酮组大鼠小肠组织EB含量较模型组降低(P<0.05;图2)。

图2 花姜酮对肠道血管通透性的影响(n=6)a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与模型组比较。

2.4 花姜酮对NLRP3、ASC阳性细胞数量的影响

对照组大鼠小肠组织和肠系膜淋巴结组织中NLRP3、ASC几乎无阳性细胞。与对照组比较,模型组大鼠小肠组织和肠系膜淋巴结中NLRP3、ASC阳性细胞数增加(P<0.05);与模型组比较,花姜酮组大鼠小肠组织和肠系膜淋巴结中NLRP3、ASC阳性细胞数减少(P<0.05;表2)。

表2 各组大鼠NLRP3、ASC阳性细胞数量的比较 个

2.5 花姜酮对Casepase-1蛋白表达的影响

与对照组比较,模型组大鼠小肠组织和肠系膜淋巴结中Casepase-1蛋白表达水平增加;与模型组比较,花姜酮组大鼠小肠组织和肠系膜淋巴结中Casepase-1蛋白表达水平下降(图3)。

图3 花姜酮对大鼠小肠组织和肠系膜淋巴结中Casepase-1蛋白的影响(免疫组织化学染色法,200×)a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与模型组比较。

2.6 花姜酮对大鼠小肠黏膜组织中sIgA蛋白的影响

与对照组比较,模型组大鼠小肠黏膜组织sIgA蛋白表达水平降低;花姜酮组大鼠小肠黏膜sIgA蛋白表达水平较模型组大鼠升高(图4)。

图4 花姜酮对大鼠小肠黏膜组织中sIgA蛋白的影响(免疫组织化学染色法,200×)a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与模型组比较。

3 讨 论

SAP可引发多器官功能衰竭,肠道屏障功能障碍是SAP发生级联反应的关键[8]。炎症介质和细胞因子的释放是造成肠黏膜屏障损伤的主要原因。肠道免疫功能可以避免不当的免疫反应,让抗炎和促炎处于平衡状态[9]。因此,通过调节免疫炎症反应防止肠道黏膜屏障损伤是改善SAP的重要措施。

HE染色结果显示,模型组大鼠小肠肠壁充血、水肿,有大量炎症细胞浸润,黏膜上皮细胞坏死,肠道细胞出现严重损伤。EB为一种常用的偶氮染料,可根据其是否穿过血管壁进入组织来评价血管通透性。组织EB渗出量升高,血管通透性增强,反之血管通透性降低。本研究EB染色结果显示,模型组大鼠小肠组织EB渗出量升高,提示SAP大鼠小肠通透性增大;MPO是一种含血红素辅基的蛋白酶,可通过调节NO对血管信号传递和舒张的作用,改变血管内皮的炎症反应性。因此MPO、NO是临床上评估炎症程度的重要指标。本研究模型组大鼠血清和小肠组织中ET水平和炎症因子IL-1β、TNF-α、NO及MPO水平较对照组升高,表明SAP大鼠建模成功,SAP大鼠肠黏膜屏障功能严重损坏或破坏,无法有效防止SAP大鼠中细菌和ET易位到血液中,这与相关研究结果相符[10-11];而花姜酮能有效改善SAP大鼠肠道损伤,降低肠道通透性,抑制血清和组织中ET、IL-1β、TNF-α、NO及MPO水平;提示花姜酮对SAP大鼠肠黏膜屏障功能具有保护作用。

NLRP3是机体固有免疫系统的重要成分,NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC和Casepase-1及炎症细胞因子组成,活化的Caspaes-1不仅可诱导多种炎症相关的细胞因子表达,而且在炎症反应中反过来激活炎症小体,引起瀑布样炎性反应[12]。Lu等[13]报道,NLRP3、ASC表达少的SAP大鼠,其胰腺炎症反应明显减轻。免疫荧光法和免疫组织化学染色法结果显示,模型组大鼠小肠组织和肠系膜淋巴结中NLRP3、ASC、Casepase-1表达均较对照组明显升高;模型组大鼠血清和组织中IL-1β、TNF-α水平较对照组升高,提示SAP大鼠固有免疫细胞过度激活会破坏肠道免疫平衡,产生过度炎性反应;花姜酮能降低NLRP3、ASC、Casepase-1及IL-1β、TNF-α表达;提示花姜酮可通过下调NLRP3蛋白、衔接蛋白ASC和Caspase-1前体蛋白表达,从而抑制NLRP3炎症小体的活化,避免固有免疫细胞过度激活引起的炎症反应,改善SAP大鼠的肠损伤。

sIgA由小肠黏膜固有层中的浆细胞产生,是黏膜局部免疫反应的主要抗体,其水平代表局部体液免疫功能[14]。在肠道内,sIgA能够抵抗蛋白水解,抵御细菌和毒素入侵,抑制过度炎性反应,减少肠黏膜损害。Sun等[15]报道SAP患者血清中sIgA水平显著降低。本文免疫组织化学染色法显示,花姜酮组大鼠小肠黏膜sIgA较模型组升高,推测花姜酮可通过上调sIgA水平,调节局部体液免疫功能。

综上所述,花姜酮对SAP大鼠肠黏膜屏障具有保护作用,其机制可能与上调sIgA水平,抑制NLRP3炎症小体活化,调节肠道免疫功能有关。