hsa_circ_100395对胃癌细胞HGC-27、MGC-803增殖、侵袭和迁移的影响

毛星荐, 高其亮, 夏冬静, 师权

都江堰市人民医院 1.医学检验科,2.消化内科,四川成都 611830

胃癌(gastric cancer,GC)是癌症相关死亡的第三大原因[1]。近年来,随着GC诊断和治疗策略的发展,其发病率和病死率逐步下降[2]。由于肿瘤的侵袭性和复发性,GC患者5年总生存率仍低于29%[3]。研究发现,环状RNA(circular RNA,circRNA)参与癌症发展,在胃癌、肺癌、肝细胞癌和结直肠癌等多种癌症中异常表达[4]。circRNA通过充当编码肽、蛋白质诱饵或微小RNA(microRNA,miRNA)来调节一系列细胞过程[5]。Chen等[6]研究发现,hsa_circ_100395对肺癌的发展起负调控作用,而hsa_circ_100395对胃癌的影响尚未见报道。因此,本研究探究hsa_circ_100395在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,旨在为胃癌的分子靶向治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

胃癌细胞系HGC-27和MGC-803购自中国科学院上海细胞库。54只雄性昆明裸鼠(4周龄,体质量16～19 g)购自中国医科大学,许可证号:SYXK(辽)2018-0008。LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂盒购自美国Thermo Fisher Technology公司;CCK-8试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司;总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;反转录试剂、TB Green荧光试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司;hsa_circ_100395过表达或沉默质粒由上海生工生物工程有限公司合成。IX73倒置显微镜购自日本Olympus公司;实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。酶标仪购自美国BioRad公司。

1.2 样本来源

收集2017年10月—2019年10月本院72例GC患者的胃癌组织及癌旁正常组织,其中男41例,女31例,年龄28～75岁,平均(50.63±11.34)岁。根据文献[7]进行TNM分期。所有患者术前未接受任何放、化疗,且术前无远处转移;手术后立即将组织冷冻并保存在-80 ℃冰箱。所有患者均签署书面知情同意书,本研究经本院伦理委员会批准。

1.3 胃癌组织RNA分离和定量分析

提取胃癌及癌旁组织中总RNA,使用Nanodrop检测RNA浓度及纯度,使用反转录试剂盒合成cDNA,进行qRT-PCR检测。使用primer premier 6.0软件设计荧光定量PCR引物。qRT-PCR反应条件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,循环40次;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,以GAPDH为内参基因。hsa_circ_100395引物序列F为5′-ATCACGCCGTAGTGGATTGGT-3′,R为5′-GTGCTCTCTGTCTCTGCTT-3′;GAPDH引物序列F为5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′,R为5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。

1.4 细胞培养和分组

胃癌细胞系HGC-27和MGC-803使用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清FBS和100 μg/mL青霉素和链霉素),在37 ℃和5%CO2培养箱中培养。将HGC-27和MGC-803细胞分别分成过表达组(转染hsa_circ_100395过表达质粒)、沉默组(转染hsa_circ_100395沉默质粒)和对照组(转染空质粒)。根据LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂盒说明进行转染。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖

将约2 000个转染的细胞接种到96孔板孔中,在37 ℃和5%CO2条件下孵育。每孔添加10 μL CCK-8溶液继续孵育24 h后,使用酶标仪检测450 nm处光密度值(optical density,OD)。

1.6 划痕愈合实验

细胞转染48 h后,在6孔板中培养至5×105个/孔。随后,用无菌微量移液器从孔中心刮擦细胞,划痕后0、24 h拍摄代表性图像。使用Image-Pro Plus分析软件对迁移距离进行定量分析。划痕愈合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.7 Transwell小室实验

将约5×104个转染的细胞悬浮在200 μL无血清培养基中,并在没有Matrigel的情况下接种到上腔室中进行迁移测定。将含有200 μL无血清培养基8×104个转染细胞接种到含有Matrigel涂层的Transwell上腔室中进行侵袭测定。10%FBS培养基作为化学吸引剂添加到下腔室中。细胞孵育24 h以进行迁移测定,孵育48 h以进行侵袭测定。除去小室顶部的细胞,然后将小室底部用4%多聚甲醛固定20 min,再用0.1%结晶紫染色20 min,计数迁移和侵袭细胞,并在显微镜下拍片。

1.8 裸鼠成瘤实验

随机选取27只裸鼠注射HGC-27细胞,27只注射MGC-803细胞,然后分别将其均分为对照组、沉默组和过表达组,每组9只。根据GenBank报道的hsa_circ_100395序列,使用cDNA模板通过PCR扩增获得双链DNA片段。构建重组质粒,并转化感受态DH5a。将阴性对照质粒和重组质粒克隆,得到重组慢病毒载体。通过大量的阳性克隆扩增感受态细胞。将含有重组载体的脂质体转导到细胞中,将其制备成稳定的单细胞悬浮液。

以PBS∶Matrigel为1∶1比例制备单细胞悬液(1×106个细胞/200 μL)。戊巴比妥钠麻醉裸鼠后,在裸鼠右后侧皮下注射细胞悬液。对照组注射转染阴性对照质粒的细胞悬液,沉默组注射转染hsa_circ_100395沉默质粒的细胞悬液,过表达组注射转染hsa_circ_100395过表达质粒的细胞悬液。将裸鼠饲养在相同的环境中,每3天观察1次。接种28天后对裸鼠实施安乐死,计算肿瘤质量和肿瘤体积。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 hsa_circ_100395在胃癌组织中的表达与临床病理特征关系

与癌旁正常组织(1.00±0.06)比较,胃癌组织hsa_circ_100395表达水平(0.35±0.03)明显下调(P<0.05)。根据hsa_circ_100395在胃癌组织中的表达水平分为高表达(≥0.35)27例和低表达(<0.35)45例。hsa_circ_100395高表达与低表达在组织分化程度、浸润深度及TNM分期上差异有显著性(P<0.05;表1)。

表1 hsa_circ_100395表达水平与临床病理特征关系 例(%)

2.2 hsa_circ_100395抑制胃癌细胞增殖

与对照组比较,过表达组HGC-27和MGC-803细胞增殖降低(P<0.05),沉默组HGC-27和MGC-803细胞增殖升高(P<0.05;图1)。

图1 hsa_circ_100395对胃癌细胞增殖的影响a为P<0.05,与对照组比较。

2.3 hsa_circ_100395抑制胃癌细胞迁移

与对照组比较,过表达组HGC-27和MGC-803细胞划痕愈合率显著降低(P<0.05),沉默组HGC-27和MGC-803细胞划痕愈合率显著升高(P<0.05;图2)。

图2 hsa_circ_100395对胃癌细胞迁移的影响A为划痕愈合实验检测细胞迁移(200×);B为划痕愈合率柱状图。a为P<0.05,与对照组比较。

2.4 hsa_circ_100395抑制胃癌细胞侵袭

与对照组比较,过表达组HGC-27和MGC-803细胞相对迁移细胞数和相对侵袭细胞数显著降低(P<0.05),沉默组HGC-27和MGC-803细胞相对迁移细胞数和相对侵袭细胞数显著增加(P<0.05;图3)。

图3 hsa_circ_100395对胃癌细胞迁移和侵袭的影响A、B分别为HGC、MGC803细胞迁移和侵袭的Transwell小室实验(200×);C为迁移侵袭细胞数柱状图。a为P<0.05,与对照组比较。

2.5 hsa_circ_100395抑制胃癌细胞体内生长

与对照组比较,过表达组HGC-27和MGC-803细胞的裸鼠移植瘤体积和肿瘤质量显著降低(P<0.05),沉默组HGC-27和MGC-803细胞的裸鼠移植瘤体积和肿瘤质量显著升高(P<0.05;图4)。

图4 hsa_circ_100395对裸鼠移植瘤生长的影响(n=9)A为各组裸鼠移植瘤瘤体图;B为肿瘤体积比较;C为肿瘤质量比较。a为P<0.05,与对照组比较。

3 讨 论

GC是胃肠道恶性肿瘤中最常见的癌症之一,在全球范围内具有很高的病死率[8]。手术是GC早期治疗的主要方法。由于GC的症状不明显且不具有特异性,发现时已到中晚期[9]。手术对于晚期GC患者来说风险较大,故一般使用化学疗法和放射疗法等,但晚期患者的治愈率较低。同时,胃癌的高复发性和转移性使其治疗难度加大,患者总生存期很低[10-11]。因此,深入研究胃癌的发病机制具有临床意义。

高通量测序分析和生物信息学方法发现了更多功能circRNA[12]。circRNA作为人细胞中稳定且普遍存在的非编码RNA,可通过结合特定的miRNA竞争性地抑制靶基因,调节细胞增殖,分化和凋亡,并参与肿瘤发生[13-14]。Shao等[15]报道,有308个circRNA在胃癌中差异表达,其中34.74%表达上调和65.26%表达下调。本研究结果显示,hsa_circ_100395在胃癌组织中表达明显下调,且与胃癌组织的分化程度、浸润深度及TNM分期呈正相关。环状RNA数据库(http://www.circbase.org)查询结果显示,hsa_circ_100395位于1q25.1染色体上,长度约为671个核苷酸,由KLHL20 mRNA的4个外显子组成。此外,hsa_circ_100395在人胃癌细胞系(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27和AGS)中的表达水平显著低于人正常胃黏膜上皮细胞GES-1,其中HGC-27和MGC-803细胞中hsa_circ_100395的表达水平分别为最低和最高,因此,本研究选择HGC-27和MGC-803细胞进行研究。

与其他非编码RNA相比,circRNA具有高度的保守性和稳定性。其重要特性可能是其作为癌症诊断和治疗中理想生物标志物的潜力[16]。研究表明,circRNA与抑癌作用或致癌作用有关[17]。Zhang等[12]研究发现,circRNA circ_NRIP1促进了胃癌的发展。Liu等[18]研究表明,circRNA circ_YAP1可通过竞争性结合胃癌细胞中miR-367-5p促进p27表达,从而抑制癌细胞的侵袭和增殖。另外,circRNA circ_DLST和circRNA circ_CACTIN均能促进胃癌细胞的恶性行为[19-20]。本研究结果表明,hsa_circ_100395的表达影响胃癌细胞的生物学行为。hsa_circ_100395过表达显著抑制了胃癌细胞HGC-27和MGC-803的增殖,并减少了体外细胞的迁移和侵袭。异种移植实验表明,hsa_circ_100395过表达延迟了体内肿瘤的生长。而hsa_circ_100395水平的降低则导致相反的作用。以上结果证明,hsa_circ_100395在胃癌中发挥抑癌作用。

综上所述,hsa_circ_100395在胃癌组织中显著低表达,且上调hsa_circ_100395可明显抑制体外胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。