巨噬细胞ADAM8诱导血管平滑肌细胞去分化

邓洁锋, 米娅丽, 侯连杰, 赵国军

1.大理大学药学院,云南大理 671003;2.广州医科大学附属第六医院 清远市人民医院中心实验室,广东清远 511518

胸主动脉瘤夹层(thoracic aortic aneurysm and dissection,TAAD)是凶险的心血管疾病之一,主要病理特点为主动脉持续的局限性扩张,其直径超过正常主动脉内径的150%,由于血管直径变化,其所受到的张力也变大,在高血压的冲击下易发生夹层[1]。主动脉内血流通过破损的主动脉内膜,进入主动脉中膜,并且沿着血管延伸,撕裂原有的主动脉壁,形成血管假腔大血管疾病,若不及时治疗死亡率极高[2]。因此,深入研究主动脉夹层发生的机制将为临床上预防和治疗主动脉夹层提供新的靶点和新策略。

TAAD作为血管中膜的退行性病变[3],与血管中膜巨噬细胞浸润、炎症因子分泌和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的产生密切相关[4]。具体而言,炎症介质和MMP促使其附近的细胞外基质降解,诱导血管平滑肌细胞去分化。平滑肌细胞去分化是指平滑肌细胞分化标志基因α-actin和α-tropomyosin表达下调,细胞收缩舒张能力丢失,变为间充质细胞的过程,最终导致主动脉管壁变薄,在血压的作用下,引起主动脉管腔扩张及其内膜破裂,从而诱发TAAD[5]。

去整合素金属蛋白酶8(recombinant a disintegrin and metalloprotease 8,ADAM8)又名CD156a或MS2,是一种主要在单核细胞上表达的新型细胞表面蛋白[6]。本课题组通过生物信息学分析发现胸主动脉夹层患者和小鼠腹主动脉瘤模型中ADAM8表达显著增加,但在巨噬细胞炎症反应和平滑肌细胞去分化过程中的作用不明。本研究利用生物信息学分析巨噬细胞ADAM8过表达对血管平滑肌细胞去分化的影响。

1 材料和方法

1.1 生物信息学分析

从GEO数据库下载微阵列数据集GSE147026(胸主动脉夹层患者测序数据)和GSE17901(腹主动脉瘤小鼠测序数据),利用GEO2R筛选与胸主动脉夹层相关的候选基因并绘制热图显示差异表达基因。

1.2 主要材料

人单核巨噬细胞系THP-1、人主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)和人脐静脉内皮细胞系(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)(ATCC公司),Lipo3000(Life公司,美国),胎牛血清、DMEM高糖培养基、RPMI 1640培养基和胰蛋白酶(Gibco公司,美国),pcDNA3.1质粒(Promega公司,美国),ADAM8 pcDNA3.1过表达质粒及其引物均由北京擎科生物公司构建或合成。

1.3 细胞培养及处理

THP-1巨噬细胞按照5×105个/孔接种于6孔板,佛波酯处理48 h诱导巨噬细胞贴壁,100 μg/L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理24 h诱导炎症反应(LPS组),对照组细胞添加与LPS组等体积的磷酸盐缓冲液,收集细胞用于检测ADAM8基因表达水平。THP-1巨噬细胞按照5×105个/孔接种于6孔板,佛波酯处理48 h诱导巨噬细胞贴壁,转染质粒,继续培养48 h,收集细胞和培养基用于后续实验。血管平滑肌细胞按照3×105个/孔接种于6孔板,待细胞贴壁后,按照1∶1的比例分别在平滑肌细胞完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基)中添加转染空质粒的巨噬细胞培养基(空质粒组)或转染ADAM8过表达质粒(过表达组)的巨噬细胞培养基,观察不同培养基对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。

1.4 实时定量PCR

按照广州美基生物科技公司RNA快速提取试剂盒操作说明提取THP-1巨噬细胞RNA。按照TaKaRa公司反转录试剂盒操作说明将细胞总RNA反转录为cDNA用于后续定量PCR实验。相关基因引物序列见表1。qPCR检测ADAM8对巨噬细胞炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)和MMP表达的影响。qPCR检测过表达ADAM8的巨噬细胞培养基对血管平滑肌细胞分化标志基因α-actin和α-tropomyosin表达水平的影响。

表1 引物序列

1.5 Western blotting检测

蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白,Bradford法进行蛋白定量,12% SDS-PAGE分离,转移至PVDF膜,加入GAPDH(ab8245,1∶1 000)和ADAM8(ab236949,1∶1 000)抗体孵育过夜,PBS洗膜后加入过氧化物酶耦联的二抗,37 ℃下孵育2 h,PBS清洗后,用Bio-Rad化学发光系统检测目的条带,以GAPDH作内参。

1.6 Edu检测细胞增殖

血管平滑肌细胞以1×105个/孔接种于24孔板,在细胞汇合度达到70%时,使用BeyoClick Edu-488细胞增殖检测试剂盒进行检测。将细胞置于倒置显微镜下观察、拍照,随机挑选若干视野拍照。Edu阳性细胞率(%)=Edu阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.7 细胞划痕实验

接种于6孔板的血管平滑肌细胞汇合度达到90%时,用10 μL移液器枪头在孔内竖直划擦,DMEM高糖培养液洗涤细胞,去除悬浮细胞后照相,用不含FBS的DMEM高糖培养液继续培养。划痕后第18 h与36 h分别在镜下观察划痕处细胞迁移状态,并拍照。细胞迁移率通过Image J软件计算。

1.8 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ADAM8在巨噬细胞内特异性表达且受LPS引起的炎症反应调控

生物信息学分析结果显示,在胸主动脉夹层患者和小鼠腹主动脉瘤模型中,ADAM8显著上调(图1A)。Western blotting结果显示,ADAM8在巨噬细胞高表达,但在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞几乎不表达(图1B),且ADAM8在LPS诱导巨噬细胞炎症反应过程中表达显著增加(图1C和图1D)。

图1 ADAM8在巨噬细胞内特异性表达且受LPS引起的炎症反应调控A为热图显示胸主动脉夹层患者和腹主动脉瘤小鼠病理变化过程中差异表达基因(FC为fold change);B为Western blotting检测不同血管细胞ADAM8蛋白含量;C为qPCR检测巨噬细胞炎症反应状态下ADAM8 mRNA水平;D为Western blotting检测巨噬细胞炎症反应状态下ADAM8蛋白含量。a为P<0.05,与对照组比较。

2.2 ADAM8促进巨噬细胞炎症反应和MMP表达

与空质粒组比较,过表达组巨噬细胞ADAM8 mRNA和蛋白水平、IL-6、TNF-α、MMP-9、MMP-12和MMP-13显著增加(图2),提示ADAM8促进巨噬细胞炎症反应和MMP表达。

图2 ADAM8促进巨噬细胞炎症反应及MMP表达A为Western blotting检测巨噬细胞ADAM8蛋白含量;B为qPCR检测巨噬细胞ADAM8 mRNA水平;C为qPCR检测巨噬细胞过表达ADAM8对炎症因子和MMP表达变化的影响。a为P<0.05,与空质粒组比较。

2.3 过表达ADAM8巨噬细胞培养基促进血管平滑肌细胞去分化

过表达ADAM8的巨噬细胞培养基显著促进血管平滑肌细胞迁移和细胞增殖(P<0.05);但显著抑制血管平滑肌细胞标志基因α-actin和α-tropomyosin的表达(P<0.05;图3);提示过表达ADAM8的巨噬细胞培养基诱导血管平滑肌细胞去分化。

图3 过表达ADAM8巨噬细胞培养基促进血管平滑肌细胞去分化A为细胞划痕实验检测各组血管平滑肌细胞迁移的影响(40×);B为Edu染色评估不同来源巨噬细胞培养基对血管平滑肌细胞增殖的影响(200×);C为18、36 h后血管平滑肌细胞迁移率;D为Edu染色的统计结果;E为过表达ADAM8巨噬细胞培养基对血管平滑肌细胞标志基因表达水平的影响。a为P<0.05,与空质粒组比较。

3 讨 论

TAAD的发生隐匿、死亡率高,给人类健康和社会发展造成严重危害。TAAD作为一种炎症引起的血管中膜功能退化的主动脉疾病,与巨噬细胞炎症和血管平滑肌去分化密切相关[7]。本研究结果显示,ADAM8通过增加巨噬细胞炎症反应和MMP表达,诱导血管平滑肌细胞去分化,提示ADAM8成为TAAD治疗靶标的可能性。

ADAM蛋白是一个与再生结构相关的膜锚定细胞表面蛋白酶家族。ADAM蛋白具有两种生物学作用:①与细胞表面蛋白脱落相关的膜锚定金属蛋白酶;②参与切割不同细胞表面蛋白基质分子如受体、生长因子、细胞因子和基质金属蛋白酶的可溶性蛋白酶。ADAM家族蛋白与巨噬细胞炎症和动脉瘤发生密切相关。研究发现,血管平滑肌细胞敲除ADAM17抑制似乎可以保护小鼠免受血管紧张素Ⅱ/β-氨基丙腈诱导的腹主动脉瘤发生[8]。此外,LPS刺激促进巨噬细胞ADAM10、MMP-12和炎症相关的TNF-α、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和IL-10表达;过表达的ADAM10增加MMP-12、iNOS和TNF-α基因的表达[9]。研究表明,机体内ADAM8具有免疫特异性,仅限于免疫系统和中枢神经系统中特定细胞内,且在正常组织中表达较低[10];本研究结果显示,LPS诱导的巨噬细胞炎症反应过程中ADAM8表达上调,巨噬细胞过表达ADAM8促进细胞炎症反应和MMP表达。

主动脉中膜由主动脉平滑肌细胞和细胞外基质组成,主动脉平滑肌细胞拥有稳定的表型和强大的收缩能力以对抗强大血流冲击力,维持血管管径的稳定和血压的稳定;而主动脉中膜的退行性病变主要表现为细胞外基质降解和血管平滑肌细胞去分化,这两个特征与基质金属蛋白酶表达水平密切相关[11]。研究表明MMP-9是主动脉瘤和主动脉夹层发病的重要因素[12]。高浓度的葡萄糖溶液能上调血管平滑肌细胞MMP-2、MMP-9和MMP-14活性,抑制血管收缩或舒张功能[13]。血管平滑肌细胞过表达MMP-9促进血管平滑肌细胞增殖,抑制血管壁正常平滑肌细胞的收缩或舒张功能[14]。车前草皂苷通过抑制MMP-2、MMP-9和MMP-13表达抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖[15]。本研究结果显示,巨噬细胞过表达ADAM8显著增加巨噬细胞MMP-9表达,该培养基处理血管平滑肌细胞后,诱导细胞增殖和迁移。

综上所述,ADAM8基因在胸主动脉瘤夹层和腹主动脉瘤病变过程中显著上调,且在LPS诱导巨噬细胞炎症反应过程中ADAM8表达也增加;此外,ADAM8上调巨噬细胞炎症因子以及MMP表达,且过表达ADAM8巨噬细胞培养基促进血管平滑肌细胞增殖和迁移;提示ADAM8具有成为TAAD治疗靶标的可能性。