多组学技术在人参属药用植物抗根部病害研究中的应用

李雅淑，张宁，李冉琪，张晶晶，侯微，李亚丽，曲正义，郑培和

[1.中国农业科学院特产研究所，吉林省中药材种植（养殖）重点实验室，吉林 长春 130112；2.吉林农业科技学院，吉林 吉林 132109]

人参（Panax ginseng）、西洋参（P.quinquefolium）和三七（P.notoginseng）是我国名贵中药材，具有珍贵的药用价值，其药用部位为多年生宿根。人参生长周期长，易受多种病原菌侵染，其中根腐病和锈腐病是栽培过程中高发的根部土传性真菌病害，具有易传播、致死率高和防治难度大等特点，常造成大幅减产[1]。目前根部病害的防治多依赖化学手段，这不仅会引起药材农残超标，同时还会带来环境破坏等其他方面的问题，因此培育优良品种是进一步发展药用植物栽培产业的重要前提，培育新型抗病品种对于根部病害防治具有重要意义。

随着高通量测序技术的发展，各组学技术在植物抗病育种中的应用越来越广泛。本文综述了多组学技术在人参、西洋参和三七在抗根部病害应用中取得的研究进展。

1 基因组学

1.1 DNA分子标记

DNA 分子标记（DNA molecular markers）技术是以脱氧核糖核酸（DNA）为基础，在分子水平上研究生物体的遗传信息差异，进而揭示生物体遗传规律及表型性状规律的技术。近年来，该技术已广泛应用于药用植物亲缘关系鉴定、道地性研究和生物多样性保护等领域，其在药用植物抗病育种方面有极其广阔的应用前景[2-4]。

1.1.1 SSR分子标记 简单重复序列标记（Simple sequence repeats,SSR）又称微卫星序列标记（Microsatellite sequence,MS），是以PCR 技术为基础的分子标记技术，其串联重复的核心序列为1～6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，重复单位数目10～60 个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同[5,6]。

KIM 等[7]通过SSR 分子标记构建了人参富含微卫星序列的基因组文库，可用于人参物种的连锁分析、遗传育种和鉴定。范馨元等[8]基于EST-SSR 标记对人参、西洋参和三七进行鉴别，发现引物P2 和Q11 的组合鉴定效果最好，对于人参、西洋参和三七的市售商业产品检出率均在85%以上。在药用植物中，SSR 分子标记已广泛应用于多种药用植物种质资源遗传多样性分析，但在抗病育种中应用较少。张晶晶等[9]以人参抗、感根腐病株系基因组DNA 为模板，对SSR 多态性引物进行了人参根腐病抗病性分子标记的筛选，表明引物P29 可以将人参抗、感根腐病株系区分开来，该标记可能与人参根腐病抗性相关，可用于人参抗根腐病种质的早期筛选。

1.1.2 SNP 分子标记 单核苷酸多态性（Single nucl eotide polymorphism,SNP）是第三代DNA 分子标记，是等位基因间单个核苷酸的差异引起的多态性，包括转换、颠换、插入和缺失等。SNP 描述的是双等位基因多态性，数量远高于SSR，在生物、医学和农学等多领域得到了广泛应用[10-12]。

董林林等[13]和陈中坚等[14]通过简化基因组测序技术，发现了1 个与三七抗、感根腐病相关的SNP 位点，利用DNA 标记辅助育种，选育出三七抗病品种“苗乡抗七1 号”。对三七抗病品种的种苗等级鉴定及发病率评价表明抗病品种种苗根腐病及锈腐病发病率均显著下降，且抗性评价表明‘苗乡抗七1 号’种子、种苗和块根都对根腐病表现出明显抗性。DNA标记辅助育种有助于缩短育种年限，加快抗病品种的选育进程。

1.2 抗病基因挖掘

植物抗病基因（Resistance gene）是在植物免疫及抗病反应过程中抵抗病原微生物侵染及减缓传播的重要基因[15]。因此，寻找人参属植物抗病基因，了解抗病机制，将有助于从分子角度入手改良物种性状，对培育抗病品种具有重要意义。

病程相关蛋白（Pathogenesis-related proteins,PRs）、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）和几丁质酶（Chitinase,CHI）等是植物抗病防御反应体系中的重要组成部分。李瑞博等[16]优化了三七病程相关蛋白PnPR1 的诱导条件，为蛋白纯化及制备单克隆抗体奠定了基础。唐美琼等[17]研究表明三七PnPR10-1 基因在1～3 年生三七的根、茎、叶中表现为组成型表达，且响应三七根部根腐病病原菌胁迫，提示三七PnPR10-1 可能具有代谢调控、生长发育和抗病等重要生物学功能，并参与抗三七根腐病的防御反应。

研究表明，三七病程相关蛋白基因PnPR1[18]、PnPR10[19]、PnPR10-3[20]、PnPRlike[20]、三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因PnPGIP[21]、三七几丁质酶基因PnCHI1[22]、三七snakin 基因PnSN1[23,24]、三七defensin 类似蛋白基因PnDEFL1[24]、三七dirigent 基因PnDIR1[25,26]、三七抗病相关基因PnMAPKK1[27]、三七osmotin-like protein 基因PnOLP1[28]、三七NAC 转录因子基因PnNAC1[29]和三七转录因子基因PnMYB2[30]等表达受茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MeJA）、乙烯利（Ethree,ETH）、H2O2和水杨酸（Salicylic acid,SA）4 种逆境胁迫相关信号分子的诱导，且大部分基因响应根腐病病原菌的侵染；在洋葱表皮细胞中瞬时表达亚细胞定位载体，表明PnMYB2[30]和PnWRKY9[31]定位于植物细胞核，PnMAPKK1[27]、PnPR10-3[20]和PnPRlike[20]定位于细胞质，PnCHI1[32]、PnSN1[23,24]、PnDEFL1[24]、PnDIR1[25,26]和PnOLP1[31]定位于细胞壁；平板抑菌试验表明PnCHI1[32]、PnDEFL1[24]、PnDIR1[25,26]、PnOLP1[28]、PnPGIP[33]、PnPR10[19]、PnPR10-2[34]、PnPR10-3[20]、PnPRlike[20]、PnSN1[23,24]和PnWRKY9[31]等基因的体外重组蛋白对腐皮镰刀菌（Fusariumsolani）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）等病原菌的菌丝生长具有抑制作用；除了PnPR10、PnPR10-2 和PnNAC1 在烟草中过表达其他基因，显著提高了烟草对腐皮镰刀菌（F.solani）的抗性，推测这些基因参与三七对根腐病菌的防卫反应有关。

人参PR10 是一个多基因家族，PgPR10 蛋白有4个亚型，且该基因家族具有组织特异性功能[35]。此前报道，人参PgPR10 蛋白家族基因具有核糖核酸酶活性[36]。人参PgPR10-1 基因定位于细胞质和细胞核中，在拟南芥中过表达后，植株对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）等抗性增强。蛋白质相互作用表明PgPR10 蛋白可能在不同细胞间形成多聚复合体，在发育和防御相关机制中发挥作用。人参中PR10 的两个同源基因PgPR10-1 和PgPR10-2 在不同真菌胁迫下具有特定的功能，转录水平上，PgPR10-1 对丝核菌（Rhizoctonia solani）较敏感，PgPR10-2 对灰霉菌（Botrytis cinerea）和胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）较敏感[37]。Pulla 等[38]最初报道PgPR10-2 响应对各种非生物和生物胁迫，人参PgPR10-2 基因在根中表达丰富，其转录本对多种病原菌和非生物刺激均表现出上调，可能是通过调节核糖核酸酶活性在转基因烟草抗生物和非生物胁迫的防御反应中发挥作用。人参PgPR10-4 基因定位于细胞质，且拟南芥的转基因株系抗真菌活性增强，该基因可能通过JA 信号通路参与相关的防御反应[39]。王敏[40]的研究同样表明人参PgPR10 对人参根腐病、立枯病和黑斑病等多种病害病原菌有抑菌活性。KIM等[41]首次从人参中分离得到PR4 基因家族的基因PgPR4，该基因属于PR4 基因家族的第Ⅱ类，PgPR4 在根中高水平表达且在病菌侵染和盐胁迫下表达上调，表明PgPR4 可能在人参对致病菌的防御反应中发挥作用。孙天霞[42]发现转人参防御素基因PgPR12 和人参脂质转移蛋白基因PgPR14 的拟南芥对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和毁灭柱孢菌（Ilyonectria destructans）的抗性都较野生型植株强。

Gayathri 等[43]发现人参PgPGIP 基因响应多种真菌侵染，具有广谱的抑菌活性。有研究表明，含人参PgPGIP1 基因的转基因小麦株系对根腐病和全蚀病的抗性明显增强，说明人参PgPGIP1 基因在抗根腐病中发挥重要作用[44]。杨珊珊等[45]和Yang 等[46]首次克隆出西洋参根腐病抗性相关基因PqDELLA1，发现该基因响应腐皮镰刀菌（F.solani）的侵染，同时还发现西洋参PqbZIP1 转录因子可能介导多种激素信号通路来调节西洋参根腐病抗性。PqERF1 基因可能参与西洋参的抗病防御反应[47]。初旸等[48]以人参全基因组草图为基础，预测出7 个人参抗病相关基因家族，共1 652个基因。尹锐[49]鉴定了人参NBS（PgNBS）类抗病基因，为人参抗病育种奠定了基础。

2 转录组学

转录组学是指在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律，近年来有关药用植物转录组学的研究越来越多，包括不同部位、不同年限、不同品种以及不同处理等转录组学研究，获得了丰富的基因信息，为解析植物代谢调控机制、开发分子标记、品种改良和抗病育种等奠定了坚实的基础[50]。

有研究表明，外源茉莉酸（Jasmonic acid,JA）和水杨酸等信号分子处理能够增强植物的抗病性[51]。通过对腐皮镰刀菌（F.solani）侵染的茉莉酸甲酯预处理后三七进行转录组分析，探究外源茉莉酸甲酯诱导三七抗腐皮镰刀菌（F.solani）的分子机制，发现茉莉酸甲酯处理可诱导萜类化合物合成，参与对病原菌的防卫反应，茉莉酸和乙烯信号通路可能协同作用，积极调节三七对腐皮镰刀菌（F.solani）的防御反应。另外，WRKY转录因子在植物抵抗病原菌侵染的防御反应中发挥重要作用，三七WRKY 基因参与三七对腐皮镰刀菌（F.solani）侵染的防卫反应[30,34,52]。

对于锈腐病菌（I.destructans）侵染人参后不同时间点的转录组分析，发现乙烯应激反应、茉莉酸介导的信号通路等次生代谢活动与抗真菌防御反应协同作用，抵御病原菌侵染。锈腐病菌（I.destructans）会影响寄主人参的光合作用以及皂苷合成途径，侵染后期大部分活性氧相关基因参与了病原菌诱导的氧化损伤反应，在中后期还影响人参的细胞周期和蛋白质翻译；同时发现了447 个基因在侵染后表达，这些基因可能对抗病性具有重要意义[48,53]。在尖孢镰刀菌（F.oxysporum）侵染人参的过程中，PgSODs转录水平被高度诱导，在72 h 达到最高水平，PgCAT 在6 h 表达最高，并随着时间的推移逐渐下降，PgGPXs 和PgGS 的表达量在24 h 增加了3 倍，并维持到72 h，PgAPX 的表达量没有明显的变化[54]。根据人参和人参锈腐病菌（I.robusta）相互作用过程中的转录组数据，发现真菌细胞在侵染人参细胞后逐渐恢复正常表达水平，而宿主人参细胞中虽然存在一个相对较长的持续防御过程，但是在感染过程中持续受到抑制[55]。

孙天霞[42]建立了不同时期、不同部位的人参转录组数据库，时空关联分析筛选出18 个与人参抗胁迫相关的基因。在人参展叶期，茎中的抗胁迫基因表达较多，在参根生长期根部抗胁迫基因表达较高，包括PRs和LRR 等。张晶晶[56]在抗感根腐病人参组织中发现了8 096 个差异基因。不论是抗感根腐病的组织还是病原菌侵染前后的组织，在转录水平上，差异表达的基因大都富集在植物－病原体相互作用途径、植物激素信号转导、次级代谢物的生物合成和苯丙烷代谢等途径中，这些通路可能和抵抗病原菌侵染有关，但具体的作用机制还有待进一步研究。

3 蛋白质组学

蛋白质组学是对生命周期中特定时刻的细胞、组织、器官或有机体中存在的蛋白质进行的系统研究[57]。植物蛋白质组学是蛋白质组学的一个分支，植物受到病原菌侵害时，通过改变蛋白质的表达来完成信号的传递，引起防御反应，所以植物的抗病性和蛋白质数量、功能密切相关，通过蛋白质组学技术对差异蛋白进行定性定量分析是研究植物抵抗病原菌侵染作用机制的重要手段之一[58]。

人参红皮病干扰了碳素代谢，影响了人参营养物质和活性成分的生物合成，降低了人参的成活率和药用价值，红皮病植株较健康植株有137 个差异蛋白，大多与碳素代谢、氧化还原平衡和抗逆性相关，这些差异有助于进一步探究红皮病的致病机理[59]。孙嘉曼[60]通过双向电泳技术鉴定外源水杨酸诱导以及人参锈腐病菌（I.destructans）侵染人参的差异表达蛋白，检测到24 个丰度变化大、重复性好的差异表达蛋白，经过质谱鉴定得到22 种蛋白质，包括防卫反应、能量代谢、信号转导、蛋白合成与代谢和光合作用等相关蛋白。蔡静等[61,62]对抗根腐病及感根腐病的三七根部进行了蛋白质图谱分析，在抗病根系中发现一种分子量为28.9 kD的蛋白质，该蛋白对三七根腐病病原菌（F.solani）的生长有抑制作用，可能与抗病性有关，另外还发现了一种可用于三七根腐病免疫诊断工具的单克隆抗体Mab7。

4 代谢组学

代谢组学是系统生物学的组成部分，是对生物体内的所有代谢物进行定性定量分析的技术，同时，可与生物体的生理病理变化进行关联分析，进一步探究其作用机制。它广泛应用于微生物学、农学、食品科学和临床诊断等领域[63,64]。

植物的根系分泌物会有选择地汇集有益或有害微生物，调控根际微生物环境[65]，Xie 等[66]从豌豆根系分泌物中分离纯化出具有极性附着活性的阿拉伯半乳糖蛋白，它可能对豆科根瘤菌在豆科植物和非豆科植物根部的生长具有重要意义；Chaparro 等[67]研究表明拟南芥在不同的发育阶段产生的根系分泌物有显著差异，可能是为了执行特定的功能，这有助于协调根际环境。因此，研究人参属药用植物根系分泌物的成分及其与病原菌的关系，可以为探究植物与病原菌的互作机制提供理论依据。

张爱华等[68,69]通过毛细管电泳法测定人参根系分泌物表明，人参根系分泌的糖类和氨基酸类对人参细菌性软腐菌（Erwinia carotovora）有趋化作用，表现为高浓度抑制病原菌生长，低浓度促进病原菌生长，并且多种人参皂苷在一定浓度下都对人参主要土传病害病原菌的生长有促进作用。匙坤等[70]发现低浓度的人参总皂苷对根腐病致病菌有化学趋向性，说明人参根系低浓度的皂苷分泌物有可能促进了病原菌在人参根部的聚集和定植并侵染人参。

罗丽芬等[71]利用色谱—质谱联用仪发现，三七根系分泌物主要包括酸类、醇类和糖类等9 类物质，且根系分泌物能促进根腐病菌腐皮镰刀菌（F.solani）和恶疫霉菌D-1（Phytophthora cactorum）的生长，还能够诱导芽管的生长方向。同时，研究还发现，随着三七的生长，根际真菌和细菌群落发生了变化，一些土传病害的病原菌如尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和腐皮镰刀菌（F.solani）等显著富集，而芽孢杆菌（Bacillusspp.）和木霉菌（Trichoderma.）等有益菌则受到明显抑制，最终在土壤和植物之间形成了恶性循环[72]。赵静等[73]在三七重茬地根际土壤中检测到的苯甲酸及其衍生物等化感物质对三七根腐病菌的生长表现出低促高抑现象。三七的一些皂苷比如R1和Rb1，三七鲜根提取液及低浓度的三七总皂苷能促进根腐病病原菌的生长，进而引起根腐病的发生[74,75]。

任绪明等[76]采用高效液相色谱法研究表明，西洋参根中三七素（β-ODAP）含量的积累与西洋参根腐病的发生呈正相关，且β-ODAP 也在许多人参品种中存在，与人参根腐病的关系有待进一步研究。Nicol等[77]研究发现，人参皂苷能够促进恶疫霉菌D-1（P.cactorum）和畸雌腐霉菌（Pythium irregulare）的生长，并抑制钩状木霉（T.hamatum）的生长，这可能与西洋参的连作障碍有关。这与蒋景龙等[78]认为的人参皂苷积累的差异可能和西洋参根腐病有关相一致。同时，焦晓林等[79]研究表明，皂苷提取物浓度达40 mg/mL时，对多种根腐病病原菌有显著抑制作用，且西洋参根内酚酸物质及人参皂苷含量增加与西洋参发生根腐病时的防卫反应相关。董艳鑫等[80]发现健康和患根腐病西洋参根水提物的化感作用存在差异，表明西洋参根腐病与自身代谢差异性有关，为进一步查找差异化感物质提供依据。有机酸对很多药用植物有化感自毒作用，多种酚酸类物质处理后会导致人参锈腐病发病率升高，且能促进根腐病病原菌的生长[81,82]。李丽等[83]分析4 年生健康西洋参和患根腐病西洋参根际土壤差异代谢物，差异代谢物显示与健康组相比患病组中有机酸含量显著升高，一些糖类物质含量显著降低，可能与根腐病菌的生长有关。

5 问题与展望

随着人们对中药类健康产品需求的持续增长，各种人参属中药材都有着广阔的应用前景，但病虫害问题严重。药用植物抗病育种工作起步较晚，缺乏系统研究，而且其遗传背景复杂，育种周期长，今后应更加注重种质资源的收集与评价，使资源得以更加充分的利用。随着科技的发展，分子标记辅助育种技术可以加速育种进程，组学技术为大规模地获取植物基因序列信息、基因调控、蛋白表达以及代谢产物的变化提供了强有力的支撑。应将多组学技术综合应用于药用植物的抗逆品种选育中，对植物群体进行多组学方面的深入研究，筛选抗病资源，挖掘抗病基因，解析抗病基因转录调控机制，解码抗病蛋白表达谱，锁定抗病代谢物，培育对根部病害具有高抗性的品种，助力人参属药用植物的可持续发展。