基于网络药理学和分子对接探讨虎杖调控铁死亡治疗动脉粥样硬化作用机制*

2024-01-02赵梦涵

贵州科学 2023年6期

赵梦涵,俞琦

(贵州中医药大学,贵州贵阳 550025)

近年来,随着人口老龄化逐年增加,脑卒中、冠心病等心血管疾病的患病率和死亡率持年上升,已位于死因谱的前列,同时也是造成死亡和疾病的首要病因[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病的主要病理改变,是一种由脂质蓄积所导致的动脉内膜炎症性疾病[2]。在AS病变过程中,大量氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)聚集在受损血管内膜,产生细胞毒性,使内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞损伤,导致细胞死亡,从而加速AS发展[3]。铁死亡是一种受调控的促炎性的细胞死亡方式,主要与谷胱甘肽(GSH)的消耗、脂质的过氧化和铁代谢异常密切相关[4]。AS发生时,细胞内铁离子聚集导致铁过载,铁离子通过Fenton反应造成活性氧(ROS)堆积,使细胞氧化性死亡。研究表明,铁沉积是晚期动脉粥样硬化斑块的重要特征,铁过载可促进氧化应激、脂质过氧化等进程,增加斑块的不稳定性[5]。

研究证实,虎杖及其主要活性成分在抗AS发生和发展中发挥重要作用。虎杖具有清热解毒、利湿祛风、活血散淤(破血祛淤)等功效,主治腹泻、发热、湿热黄疸[6]。虎杖主要含有醌类、黄酮类、二苯乙烯类化合物[7]。现代药理学研究表明,虎杖在抗炎、抗血栓、抗氧化、保护心肌、抗肿瘤等方面表现出良好的药理作用[8]。虎杖可以调节AS模型兔的脂质代谢,抑制血管平滑肌细胞增殖及抗炎机制综合发挥抗AS的作用[9]。同时,虎杖及其主要活性成分也可以调节铁代谢。虎杖中的活性成分槲皮素、白藜芦醇可以抑制Fe2+积累和ROS的产生,保护铁死亡关键标志物GSH与谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性,降低脂质过氧化,从而抑制铁死亡的发生[10-11]。迄今为止,尚未阐明虎杖抑制铁死亡治疗AS的作用机制。

网络药理学可获取数目庞大、结构多样的生物信息,有利于中医药现代化的发展。本研究利用网路药理学,筛选虎杖的主要成分与靶点,系统研究“虎杖成分-靶标-疾病-通路”的网络关系,为虎杖治疗AS的临床推广提供实验基础,同时为系统了解铁死亡在AS中扮演的重要角色提供依据。

1 材料与方法

1.1 虎杖化合物的筛选和靶点预测

利用中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP(https://tcmspw.com/),以虎杖为关键词检索其所有化学成分。根据药物在体内的动态变化,对虎杖的活性成分按口服生物利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18来筛选虎杖的药效物质及相应靶点。其中活性成分虎杖苷和白藜芦醇的OB值和DL值未能通过初筛,但林园园[12]、李世环[13]研究发现虎杖苷和白藜芦醇有抗AS的作用,因此将其列入其中。在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)选取人源基因,限定物种为“human”,对靶蛋白进行匹配,将靶蛋白名称转换成对应的基因名称。

1.2 动脉粥样硬化相关靶点预测

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)输入关键词“atherosclerosis”,查找相关的靶点基因。若靶点太多,根据Score值≥中位数的方法,筛选出适当的基因,保留靶点Score值高的,值越高说明靶点与疾病关系越密切。将虎杖活性成分靶点集与AS靶点集分别输入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中获取交集靶点,即为虎杖治疗AS的潜在靶点。

1.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建

运用Cytoscape 3.9.1软件构建虎杖有效成分-交集靶点网络图。

1.4 虎杖对动脉粥样硬化的PPI网络分析

将得到的交集靶点蛋白导入到STRING 数据库(http://string-db.org/cgi/ input.pl),选择物种为“Homo sapiens”,获得蛋白间相互作用信息,构建蛋白互作网络(protein-protein interaction network,PPI),再将其导入Cytoscape 3.9.1 软件进行可视化处理。

1.5 基因富集分析

将公共靶点导入Metascape数据库(https://metascape.org/)对虎杖治疗 AS 的相关靶点进行 GO 富集和 KEGG 通路富集分析,将分析结果导入微生信(https://bioinformatics.com.cn/)生成GO柱状图和KEGG气泡图。

1.6 铁死亡调控基因获取及与虎杖、动脉粥样硬化3者靶点综合分析

在GeneCards 数据库和FerrDb数据库,查找与铁死亡相关的靶标基因。将铁死亡的靶标基因和上述虎杖与AS的交集靶点输入到Venny2.1.0中,提取其公共靶点,为虎杖调控铁死亡治疗AS的靶点。将公共靶点导入STRING 数据库,构建PPI网络,导入Metascape 数据库进行KEGG 通路富集分析。

1.7 分子对接验证

在PubChem 数据库(https://pubchem.Ncbi.nlm.nih.gov /)中查找虎杖调控铁死亡抗AS主要成分的三维结构,并使用Chem3D进行能量最小化,作为分子对接的小分子配体。将虎杖调控铁死亡抗AS公共基因中Degree排在前3位基因输入在 UniProt 数据库中,筛选公共基因所对应蛋白质 ID,限定物种为“human”,PDB 蛋白数据库中输入蛋白质ID 获得蛋白质的三维结构,作为分子对接的大分子受体。利用SYBYL-X 2.0软件对受体去水、加氢、修复侧链后和配体进行对接。

2 结果

2.1 虎杖有效成分及靶点筛选

在TCMSP数据中共得到虎杖62个化学成分,根据OB≥30%且DL≥0.18,共得化合物10个,靶点324个,将这324个靶点导入Uniprot数据库,去除无靶点者和删去重复项,加上虎杖苷和白藜芦醇,得到化合物10个,靶点252个。为方便后续研究,将化合物分别编号HZ1～HZ10,具体信息见表1。

表1 虎杖活性成分信息

2.2 虎杖与动脉粥样硬化交集靶点的筛选

以“atherosclerosis”为关键词,在GeneCards 数据库和Drugbank数据库进行检索,筛去Score值低的,共得AS直接靶点1328个。利用Venny 图在线工具分析AS靶点与虎杖有效活性成分对应靶点的共有部分,获得虎杖对抗AS的 146个预测作用靶点。见图1。

图1 虎杖活性成分靶点与动脉粥样硬化交集靶点

2.3 “虎杖-活性成分-交集靶点”网络构建

利用Cytoscape 3.9.1软件构建虎杖-有效活性成分-交集靶点网络。图2中,圈中间的为虎杖,圈的节点代表虎杖有效活性成分,三层方块圈为交集靶点,边线代表虎杖活性成分与交集靶点的相互联系。见图2。

图2 虎杖“药物-成分-靶点”网络图

2.4 PPI网络的构建

将交集靶点导入STRING数据库,设置人源物种,获得靶标相互作用关系,设置置信度为0.9,隐藏断开节点靶点,得到PPI网络图,其中包含146个节点,692条边。将PPI网络图导入到Cytoscape软件进行优化,然后使用CentiScaPe 2.2 Menu插件进行筛选,Degree Centrality为10.134,Betweenness Centrality为232.7164,Closeness Centrality为0.0028,以AKT1、MAPK3、JUN、STAT3、MAPK1为度值前5靶点。见图3。

图3 虎杖抗动脉粥样硬化作用靶点PPI网络图

2.5 KEGG通路分析与GO富集

将虎杖抗AS的146个潜在靶点导入Metascape数据库,GO富集结果中,生物过程(Biological process,BP)有1973条,细胞组成(cellular component,CC)有76条,分子功能(molecular function,MF)有156条。根据富集结果显著性较强的前10位,导入到微生信在线工具平台,做出柱状图。见图4。获取KEGG通路的富集共有189条通路,根据富集结果,显著性较强的前20位导入到微生信在线工具平台,做出气泡图。见图5。

图4 GO生物学功能富集结果

图5 KEGG信号通路

2.6 铁死亡调控基因获取及与虎杖、动脉粥样硬化3者靶点综合分析

以“ferroptosis”为关键词,在GeneCards 数据库和FerrDb数据库检索,共得铁死亡直接靶点887个。将铁死亡靶标与上述146个公共基因输入Venny图在线工具分析中,获得44个公共靶点。这44个基因既是虎杖作用靶点,也是抗AS的靶点,同时也是铁死亡调控基因。如图6。将这44个公共靶点导入 STRING 数据库,获得PPI网络图,在Cytoscape 软件进行优化,度值前三的靶点为TP53、JUN、IL-6。如图7。对这44个靶点进行KEGG通路分析,根据富集结果,显著性较强的前20位导入到微生信在线工具平台,做出气泡图,富集较强的为MAPK信号通路。见图8。

图6 虎杖调控铁死亡抗动脉粥样硬化交集靶点

图7 虎杖调控铁死亡抗动脉粥样硬化靶点PPI网络图

图8 虎杖调控铁死亡抗动脉粥样硬化KEGG信号通路

2.7 分子对接

为了验证虎杖调控铁死亡抗AS,最后对分子对接进行研究。受体选用上述44个公共靶点的前3个,即TP53(PDB ID:1TUP)、JUN(PDB ID:1JNM)、IL-6(PDB ID:4CNI)。配体选用虎杖10个关键中药成分。在进行对接时,以总打分值(Total Score)≥ 5为筛选条件筛选对接结果较好的化学成分,总打分值越高说明结合较为稳定。对接结果中,TP53和IL-6有4个活性成分的Total Score>5,JUN有3个活性成分的Total Score>5,1个活性成分Total Score>4。对接评分如图9。最后对接结果较好的化学成分和蛋白晶体进行可视化。如图10。

图9 分子对接结果

图10 分子对接可视化

3 讨论

研究表明,AS致病机制较为复杂,经过大量的研究,目前存在的学说有炎症反应学说、脂质代谢学说、糖尿病学说、氧化应激学说等[14-16]。对AS准确预防和治疗尚不明确。铁死亡的主要机制与GSH/GXP4抗氧化系统活性、脂质过氧化程度、铁代谢等多个途径有关,并且参与AS多个病理过程,成为研究AS的新靶点[17]。中草药的功效是多靶点、多途径、多种活性物质共同作用的结果,在调控铁死亡中有独具优势。网络药理学具有系统性和整体性的特点,通过“多成分-多靶点-多通路”相互作用网路来分析中草药的复杂性[18],为临床防治提供理论依据。本研究首次将铁死亡与网络药理结合,通过药物靶点-疾病靶点及铁死亡相关靶点三者结合取交集,同时结合分子对接技术验证药物成分与AS铁死亡靶点结合能力,从铁死亡角度进一步证实虎杖治疗AS的部分分子机制。

通过在数据库的检索,筛选出10个有效活性成分和146个抗AS作用靶点,最终得到虎杖抗AS的重要活性成分——白藜芦醇和槲皮素。这146个靶点再与铁死亡调控基因分析,得到44个公共靶点,而 TP53、JUN与IL-6是AS铁死亡过程中的主要靶点。研究显示,越来越多的基因被发现可以调控铁死亡的进程,其中这三位关键靶点也包含其中。研究报道,TP53是铁死亡中的枢纽基因[19]。TP53基因调控细胞死亡模式,影响氧化还原状态,从而改变代谢过程和对铁死亡的反应[20]。何信用[21]等研究发现,TP53激活铁死亡的病理过程,谷胱甘肽(GSH)合成降低,引起GPX4活性降低,抗氧化能力降低,ROS升高,诱发细胞死亡,导致氧化损伤,加剧AS病情发展。IL-6在驱动铁死亡表达中起着关键作用[22]。Yang[23]等研究发现,通过NF-κB途径诱导IL-6,增加血清铁浓度和转铁蛋白饱和度的表达,增加了铁死亡。Zheng[24]等研究表明,经过体内验证得出,JUN是铁死亡的相关靶点和生物标记物,并可作为预防心血管事件的重要靶点。研究报道,白藜芦醇显著降低血清与胸主动脉中IL-6水平,减缓炎症反应,从而减轻AS的发展[25]。同时,白藜芦醇诱导TP53蛋白水平增加,加强 TP53基因的启动子活性[26]。研究发现,槲皮素抑制脂多糖诱导炎症动物模型中JUN和IL-6蛋白水平的上调,减轻炎症反应[27]。TP53、IL-6、JUN靶点可能与AS的铁死亡发生发展密切相关,而白藜芦醇和槲皮素可能抑制这些基因在AS的表达发挥治疗作用。

通过KEGG富集分析结果显示,MAPK信号通路在AS的铁死亡中至关重要。Mu[28]等研究发现,细胞发生铁死亡后,能激活炎性信号通路,增加炎症反应,调节铁代谢可以改变T细胞、B细胞等免疫细胞功能,控制炎症发生。因此,铁死亡和炎症也有密切关系。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信号从细胞外向细胞核传递途径之一,包括P38MAPK、ERK和JUN信号通路,参与炎症信号传导,并响应各种细胞内和细胞外刺激(包括氧化应激),细胞凋亡等多种病理生理过程,与AS“炎症学说”发病机制最为密切[29]。Zhao[30]等研究发现,AS模型的大鼠中通过促进P38、ERK、JUN表达,激活MAPK信号通路,加重AS症状,该发现与本文所得出研究结果相符。另外,槲皮素降低促炎因子的表达,如IL-6和IL-17A,抑制TNF-α诱导MAPK通路激活[31]。Meng[32]等研究发现,槲皮素可以提高抗氧化能力并抑制磷酸化MAPK和NF-κB的表达。

虎杖可能通过槲皮素和白藜芦醇介导MAPK信号通路,减缓AS的铁死亡炎症反应。白藜芦醇也可消除大鼠血清ROS水平升高,下调HIF-1α蛋白表达,抑制MAPK通路,减缓炎症反应[33]。因此,虎杖可能通过槲皮素和白藜芦醇介导MAPK信号通路,减轻AS的铁死亡炎症反应。

本研究将关键活性成分和核心靶点对接在分子水平,结果表明,槲皮素和白藜芦醇能够与TP53、JUN、IL-6成功对接,总分在5.0以上,表明关键成分于靶标具有较强的结合力。