罗汉果茎段组织培养与植株再生体系的研究

席培宇,郭玉琳,吴凤婵,李安定

(贵州省生物研究所,贵州 贵阳 550000)

0 引言

罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是葫芦科多年生藤本植物,其种质资源主要集中在广西省永福县、龙胜县等地,它的果实具有化痰止咳、清肺润肠的功效,且同时富含多种维生素、蛋白质等营养成分[1-2]。此外,果实中的甜苷V(MogrosidesV)是非糖甜味物质之一,甜度为蔗糖的300～400倍,是糖尿病人、高血压等患者的理想糖类替代品,因此享有“神仙果”“东方神果”等美誉,是卫生部首批公布的药食两用中药材[3-4]。近年来,医药行业及食品生产企业对罗汉果的需求逐年增加,带动了全国罗汉果种植业的蓬勃发展。贵州铜仁市江口县、榕江县等地也开始大面积种植青皮罗汉果。

当前,罗汉果的繁殖方式主要采用扦插或压蔓。但是无性繁殖会随着代数的增加导致种性退化,产生较多病毒病,导致产量大幅度下降[5]。目前利用组织培养技术培育脱毒的罗汉果种苗是解决罗汉果品种退化问题的重要手段之一。利用组培技术建立罗汉果不定芽诱导、增殖、生根培养体系,经壮苗驯化后能够培育出优质的罗汉果种苗[6]。本实验以罗汉果的茎段为外植体,探究不同消毒剂、消毒时间、不同外源添加物种类及浓度配比对罗汉果茎段组织培养的影响,并优化出最佳组培快繁条件,缩短培养周期,提高增殖效率,建立高效的罗汉果植株再生体系,为规范化生产优质罗汉果种苗提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为青皮罗汉果,于2022年8月取自铜仁市江口县罗汉果种植基地,剪取健壮、无病虫害罗汉果幼苗的植株嫩茎。

1.2 试验方法

1.2.1 基础培养基及丝瓜络提取物的制备

基础培养基:MS加入25 g/L蔗糖,7 g/L琼脂和0.5 g/L的花宝1号;芽诱导和芽增殖培养基:MS基础培养基添加不同种类及浓度的植物激素制备;生根培养基以1/2 MS加25 g/L的蔗糖,7 g/L的琼脂,0.5 g/L的花宝1号和0.2 g/L的碳粉为基础培养基。调节pH在5.8。

丝瓜络提取物的制备方法:将丝瓜络与水按体积比1∶1混合后,先大火煮沸,之后文火煮15～20 min,过滤得第一次滤液和滤渣,将滤渣与水按体积比为1∶1混合后,先大火煮沸,之后文火煮15～20 min,过滤得第二次滤液;将第一次滤液和第二次滤液合并后,减压浓缩为原体积的1/10～1/8,得到丝瓜络提取物。

1.2.2 外植体消毒

将罗汉果幼嫩枝条用清水洗净,用0.05%的高锰酸钾溶液浸泡25 min,用超纯水清洗干净后,放入超净工作台中;将罗汉果幼嫩枝条剪成约0.5 cm的带腋芽小段,先用灭菌水冲洗3～5遍,再分别用0.1%的升汞处理6 min、8 min、10 min,用灭菌水冲洗3～5遍后,分别用75%乙醇处理30 s、1 min,最后用灭菌水冲洗3～5遍,置于无菌滤纸上,吸干表面水分后接种于MS无添加任何激素的基础培养基上,每个处理接种10瓶,每瓶接种3个带腋芽小段,置于25 ℃±2 ℃下暗培养一周进行预培养,7 d后统计污染率和成活率。

1.2.3 不定芽诱导培养

将预培养一周的无菌茎段分别接种在MS+丝瓜络提取物(1.0 mg/L,2.0 mg/L,3.0 mg/L)的培养基上,每个处理接种10瓶,每瓶接种2个茎段,置于25 ℃±2 ℃,光照12 h/d,强度1000 lx的温室中培养,21 d后统计腋芽成活率,筛选出最佳芽诱导培养基。

1.2.4 不定芽继代增殖培养

切取诱导出的不定芽分别接种到继代增殖培养基中MS+丝瓜络提取物(0.8 mg/L,1.0 mg/L,1.2 mg/L)+NAA(0.08 mg/L,0.1 mg/L,0.12 mg/L),置于25 ℃±2 ℃培养室培养,每日光照12 h,光照强度1000 lx,21 d后统计芽增值率,筛选出最佳芽增殖培养基。

1.2.5 生根培养

将生长健壮的芽苗转移至生根培养基中,25 ℃±2 ℃培养室培养,每日光照16 h,光照强度1000 lx。生根培养基 :1/2 MS+IBA(0.05 mg/L,0.1 mg/L,0.15 mg/L)+NAA(0.05 mg/L,0.1 mg/L,0.15 mg/L),3～4周后统计生根率,筛选出最佳生根培养基。

1.2.6 炼苗与移栽

待组培苗长出4～5根主根,3～5片新叶,高约10 cm时将瓶盖逐渐打开,往培养瓶里加少量灭菌水保湿,温室炼苗3～5 d后将组培苗拿出来,用灭菌水把根部残留的培养基洗干净,并适当修剪叶片和根长,后将组培苗接种在3种经过灭菌处理的不同组合基质中,炼苗在大棚中进行,自然光照和自然温度。3种基质组合分别为A:蛭石+珍珠岩(2∶1)、B:蛭石+珍珠岩+苔藓(2∶1∶1)、C:蛭石+珍珠岩+苔藓+树皮(1∶1∶1∶1)。其中苔藓覆盖在表面用于保湿,移栽后需加强通风换气保湿,3个基质组合,每个处理16株组培苗,4周后观察并统计移栽苗的生长情况。

1.3 数据分析

污染率=(污染个数/外植体总数)×100%,成活率=(成活个数/外植体总数)×100%,芽诱导率=(新萌芽数/外植体总数)×100%,增殖系数=新诱导不定芽数/接种茎段芽数,生根率=生根个数/接种数,用Excel软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒试剂及消毒时间对外植体处理效果的影响

由表1可知,在相同时间0.75%乙醇处理下,随着0.1%氯化汞消毒时间的增加,芽成活率整体呈先升后降的趋势,污染率整体呈下降趋势。在0.1%氯化汞消毒8 min和75%乙醇消毒30 s时,芽成活率最高,为81.4%;在0.1%氯化汞消毒10 min和75%乙醇消毒60 s时,芽成活率、污染率均最低,分别为35.7%和6.7%。这说明随着消毒时间进一步延长,对外植体内部结构可能造成损伤,导致成活率降低;而污染率与消毒剂处理时长呈正相关,处理的时间越长,污染率越低。研究结果表明,0.1%氯化汞溶液消毒8 min和75%乙醇消毒30 s处理的茎芽成活率最高。

表1 不同消毒试剂及消毒时间对外植体处理效果的影响

2.2 不同激素对罗汉果芽诱导的影响

将预培养一周的无菌带腋芽茎段分别接种于含不同浓度丝瓜络提取物的培养基中进行芽诱导培养,见表2。由表2可知,随着丝瓜络提取物浓度的增多,芽诱导率是先上升后下降,当丝瓜络提取物浓度为2.0 mg/L时,芽诱导率最高,为92%,且长势较好(图1(b));当浓度≤1.0 mg/L时,芽细小,叶片淡绿色且生长缓慢(图1(a));当浓度为≥3.0 mg/L时,会导致叶片发黄甚至褐化死亡(图1(c))。本研究结果表明,丝瓜络提取物浓度为2.0 mg/L时,是诱导芽的最佳浓度。

图1 丝瓜络提取物不同浓度对罗汉果芽诱导的影响

表2 不同丝瓜络提取物浓度对芽诱导的影响

2.3 不同激素对罗汉果芽增殖的影响

切取诱导出来的新芽苗接种到继代培养基中进行增殖培养。从表3得出,丝瓜络提取物、NAA浓度均影响新生芽个数,当丝瓜络提取物浓度相同时,培养基中NAA的浓度影响芽苗的增殖能力,NAA浓度为0.08 mg/L时,芽增值率较低(图2(a));NAA浓度为0.12 mg/L时,容易分化产生愈伤组织(图2(c))。本研究结果表明,MS+丝瓜络提取物1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L时,新生芽个数最多,芽茎粗壮,叶片大且绿,是诱导芽增殖的最佳培养基,如图2(b)所示。

图2 不同浓度NAA对芽增值的影响

表3 不同丝瓜络提取物浓度和植物激素对芽增值的影响

2.4 不同激素对罗汉果生根培养的影响

将继代培养后长势比较好的罗汉果芽苗接种到生根培养基中继续培养3～4周。从表4得出,罗汉果的生根率都会受到生长素IBA和NAA的影响,当IBA(NAA)浓度相同时,随着NAA(IBA)浓度的增加,根诱导率先增加后减少,当IBA和NAA浓度均为0.1mg/L时根诱导率高达93%,且主根较粗,苗长势较好,具体表现如图3。所以优化出的最佳生根培养基是1/2 MS+ 0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。

图3 不同植物激素组合对罗汉果生根的影响

表4 不同激素对罗汉果生根的影响

2.5 不同基质对罗汉果组培苗炼苗的影响

所述几种基质组合对罗汉果组培苗生长的影响不同。适应4周后,结果如表5。由表5可知,大部分组培苗长势较好,其中以组合B的基质配比为最好,成活率高达100%,苗的茎叶由嫩绿变深绿,且比较健壮。由此可见,珍珠岩+蛭石+苔藓的基质组合可以同时起到较好的疏水、保水及透气的作用,有助于罗汉果组培苗的生长,炼苗过程如图4。

图4 炼苗的过程

表5 不同基质组合对组培苗炼苗移栽成活率及生长的影响

3 讨论

植物组织培养可以保持母本的优良性状,缩短繁殖周期,提高繁殖效率,而前期外植体消毒是影响成活率的关键因素。本试验中,先用0.05%的高锰酸钾溶液浸泡25 min进行初步消毒,0.1%氯化汞处理时间6 min,乙醇处理时间30 s时,污染率最高,说明灭菌时间短导致灭菌不彻底;而当0.1%氯化汞处理时间为10 min时,乙醇处理时间为60 s时,污染率达最低,但成活率也最低,说明灭菌时间过长对外植体内部组织造成了一定伤害;当0.1%氯化汞处理时间为8 min,乙醇处理时间为30 s时,成活率最高;成活率与0.1%氯化汞处理时间呈先上升后下降的趋势,整体趋势与唐凝[7]试验结果相同,唐凝发现用0.1% 氯化汞处理6 min时,成活率最高,达85%,与本试验结果不一致,可能与外植体的幼嫩程度相关。

细胞分裂素在组织培养中可以有效促进细胞分化、分裂、形成不定芽,对不定芽的诱导和发育起重要作用[9]。本试验前期尝试过用6-BA进行罗汉果的芽诱导及芽增值,但发现效果不如丝瓜络提取物,故本试验采用丝瓜络提取物进行芽诱导及增值试验。丝瓜络为葫芦科植物丝瓜的干燥成熟果实的维管束,为多孔结构,通常用作洗碗或者中药,本实验创造性的将丝瓜络提取物用于罗汉果组培育苗,发现丝瓜络提取物对罗汉果芽诱导、芽增殖具有很好的促进作用,能够在短时间内培育出更优质的种苗,对于罗汉果离体再生培育体系具有重要意义。植物激素配比可以有效提高不定芽的增殖效率[9],低浓度的NAA可以促进不定芽的生长。本试验中,采用不同浓度的NAA和丝瓜络提取物进行配比,研究结果表明,MS+1.0 mg/L丝瓜络提取物+ 0.1 mg/L NAA时,芽的增殖系数最高,为芽增殖培养的最佳培养基。

此外,本试验中,通过芽增殖培养的芽苗在1/2 MS+1.0 mg/L IBA +1.0 mg/L NAA +0.2 mg/L碳粉的培养基中生根率较高,达93%。生根苗在不同种类及配比的基质中生长状况不一样,本试验中绝大多数组培苗生长状况良好,其中以组合B的基质配比为最好,成活率最高,苗的茎叶颜色加深,且比较健壮。由此可见,珍珠岩+蛭石+苔藓的基质组合可以同时起到较好的疏水、保水及透气的作用,有助于罗汉果组培苗的生长,且移栽前在温室炼苗3～5 d有助于提高组培苗移栽后的成活率。

4 结论

本试验以青皮罗汉果茎段作为外植体,用0.05%的高锰酸钾溶液浸泡消毒25 min,0.1%的升汞消毒8 min,75%的乙醇消毒30 s,成活率达81%;此外,筛选出最佳芽诱导培养基为MS+2.0 mg/L丝瓜络提取物浓度,诱导率达到92%;筛选出芽增值最佳培养基为MS+1.0 mg/L丝瓜络提取物浓度+0.1 mg/L NAA,增殖系数达2.43;生根培养的最佳培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA+0.2 mg/L碳粉,生根数在5～9条之间,生根率高达93%;最佳炼苗基质组成为:蛭石∶珍珠岩∶苔藓体积比=2∶1∶1,移栽成活率达100%。

本试验的目的是提供一种罗汉果茎段的组培快速育苗方法,利用本试验方法可快速获得罗汉果优质种苗,解决罗汉果传统育苗受到合格繁殖材料的限制问题,同时为贵州罗汉果产业的可持续发展提供技术支撑。