余干乌骨鸡胸腺4种内分泌细胞超微结构特点和形态计量学分析

龚美玲,刘洋铨,叶亚琼,赵海全,张 晖,2

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东 佛山 528225 ; 2.江西农业大学动物科学技术学院,江西 南昌 330045)

动物机体内神经内分泌网络通过神经递质、肽类激素和细胞因子相互作用,共同调节和维持机体的正常生理功能。胸腺器官在神经内分泌免疫网络中具有重要的地位[1]。胸腺中含有大量的淋巴细胞,但同时也有少量的上皮网状细胞和内分泌细胞。因此,胸腺既是重要的中枢免疫器官,又是神经内分泌器官[2]。胸腺作为培育和选择T细胞的场所,未成熟的T细胞在多种趋化因子的作用下进入胸腺后,胸腺通过其内分泌细胞分泌多种激素和神经肽,包括胸腺素、胸腺生成素和血管活性肠肽等,诱导T细胞分化成熟,维持机体内环境稳定[3]。先前的研究认为,哺乳动物胸腺的内分泌功能主要由上皮网状细胞完成[4]。然而,有研究在人类胎儿胸腺中检测到嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A,CGA)阳性细胞,并证实其具有内分泌功能,该研究表明,胎儿胸腺存在胺前体摄取脱羧化(Amine precursor uptake and decarboxylation,APUD)细胞,且该细胞可分泌多种垂体激素和神经肽[5]。APUD细胞能够摄取胺前体,进行脱羧而产生肽类或活性胺。因此,APUD细胞也属于内分泌细胞。目前,已有研究先后在蛙、蛇、鹅和鸡等非哺乳动物胸腺中观察到APUD细胞,并证实APUD细胞能分泌多种激素和神经肽[6,7]。有关动物胸腺内分泌细胞形态和分类的研究通常使用普通光学显微镜和免疫组织化学方法,有关胸腺内分泌细胞的超微结构的研究较少,鸡胸腺内分泌细胞的类型、数量和形态结构还有待进一步阐明。

余干乌骨鸡是江西省特色药用型品种,其体内富含大量黑色素,其羽毛是扁平黑色,不同于泰和乌骨鸡的白色丝羽。余干乌骨鸡具有极高的药用价值和保健价值。一般认为,乌骨鸡黑色素含量越高,其药用价值和保健价值越高[8]。乌骨鸡黑色素富集多种微量元素,这些元素可以直接参与机体的细胞免疫,并且可作为三大物质代谢途径中关键酶的激活剂、辅酶和参与一些维生素的合成[9]。乌骨鸡还常用于需要补充铁元素的病人和特殊人群的功能和营养食品[10]。目前,有关余干乌骨鸡的研究多见于经济性状、养殖技术和疾病防控,其器官组织结构方面的研究甚少。胸腺是动物重要的免疫器官。胸腺结构和细胞类型的阐明,对于研究禽类免疫机理具有重要的意义。本试验应用电子显微镜技术,根据内分泌细胞的颗粒参数和结构特征,试图阐明余干乌骨鸡胸腺内分泌细胞类型。本试验结果将丰实我国特色家禽的组织学内容,同时也为实际生产中余干乌骨鸡疫苗创制和临床疾病防控等提供基础理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物和组织处理 余干乌骨鸡取自江西省农业科学院余干乌骨鸡选育课题组,公、母各2只。适应饲养24 h后,颈动脉放血处死,剖开脖颈,迅速摘取胸腺,剥除胸腺外结缔组织,用刀片将胸腺切成小块,一部分置于新配置预冷的Bouin氏固定液中固定24 h,用于石蜡包埋和普通光学显微镜观察;另一部分胸腺组织块放于2.5%戊二醛/PBS中4 ℃固定24 h,用于透射电子显微镜观察。

1.2 主要试剂 苏木精染色液和伊红染色液,均购自湖南比克曼生物科技有限公司;多聚甲醛,购自上海多沃生物客机有限公司;酒精,购自深圳可孚生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 生物组织包埋机(YD-6D),金华市益迪医疗设备厂;UC7超薄切片机(RM2245),德国 Leica;电热恒温干燥箱(GZX-DH.500BS),上海跃进医疗器械有限公司;生物显微镜(BM 2000),南京江南永新光学有限公司;透射电子显微镜(H-600),日本HITACHI。

1.4 试验方法

1.4.1 石蜡切片制作和光学显微镜观察 取出经Bouin氏固定液固定的胸腺组织块,冲洗固定液,梯度浓度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡透蜡,组织包埋。取石蜡包埋后的胸腺样品,在切片机上切成5 μm切片,载玻片捞片后晾干。胸腺切片二甲苯脱蜡后,下行梯度浓度乙醇复水,苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色,盖玻片封片,生物显微镜观察,Scope Image 9.0(H3D)软件获取显微照片。

1.4.2 透射电子显微镜观察 取经戊二醛/PBS固定的胸腺组织,用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)洗涤3次。将样品在1%OsO4中再固定2 h,在0.1 mol/L PBS中洗涤3次,上行梯度乙醇中脱水,丙酮置换,包埋剂包埋,切片机切片(60～80 nm),2%醋酸铀饱和酒精溶液和枸橼酸铅双染色,室温干燥过夜。最后,用透射电子显微镜观察并采集图像。

1.4.3 形态计量学分析 使用开放源ImageJ(FiJi)软件(美国NIH)测量内分泌细胞分泌颗粒数量和直径。使用Office Excel软件(美国微软)导出数据并进行分析。

2 结果

2.1 胸腺显微组织结构特征 余干乌骨鸡胸腺表面被覆薄层结缔组织(图1)。胸腺实质主要由外围淋巴细胞密集且染色较深的皮质和中间染色较浅且内部含有胸腺小体的髓质构成(图1A)。胸腺小体呈椭圆形,细胞密度低,不含淋巴细胞,主要有少量上皮细胞构成,有些细胞胞质嗜酸性强,呈深红色(图1B)。在胸腺中可观察到散在分布的黑色素,主要分布于皮质,髓质分布较少(图1)。

图1 余干乌骨鸡胸腺显微组织结构观察(H.E.染色,A:100×;B:400×)Fig.1 Microscopic observation of thymus tissue structure in Yugan black-bone fowl (H.E. staining,A:100×;B:400×)A:胸腺; B:胸腺皮质和髓质[C:皮质; M:髓质;黄色虚线:皮质和髓质的界线; HC:胸腺小体(红色虚线框);箭头:黑色素]A:Thymus; B:Thymic cortex and medulla [C:Cortex; M:Medulla; Yellow dotted line:Boundary between cortex and medulla; HC:Hassall corpuscle (Red dotted box); Arrow:Melanin]

2.2 胸腺超微组织结构特征 余干乌骨鸡胸腺中细胞密集,存在多种细胞型,包括淋巴细胞、网状细胞、黑色素细胞和内分泌细胞(图2)。淋巴细胞密集,数量最多,呈圆形,体积较小,细胞核不规则,占据胞体大部分,胞质较少(图2A)。上皮网状细胞位于淋巴细胞之间的间隙中,形态不规则,多突起,细胞核多边型,体积较大(图2A)。黑色素细胞位于淋巴细胞或上皮网状细胞之间,细胞呈长条形,胞质内还有数量较多的电子致密的卵圆形黑素体,直径介于319～1 702 nm,每个黑色素细胞内平均拥有39个黑素体(图2B)。

图2 余干乌骨鸡胸腺超微组织结构观察Fig.2 Ultrastructural observation of thymus tissue structure in Yugan black-bone fowlA:胸腺实质; B:胸腺皮质(RC:网状细胞; EC:内分泌细胞; LC:淋巴细胞; MC:黑色素细胞; M:黑素体)A:Thymic parenchyma; B:Thymic cortex (RC:Reticular cell; EC:Endocrine cell; LC:Lymphocyte; MC:Melanocyte; M:Melanosome)

2.3 胸腺内分泌细胞的类型和结构特征 余干乌骨鸡胸腺中内分泌细胞较多,呈圆形、椭圆或不规则形状,胞质内含有形态、大小和电子密度均不相同的内分泌颗粒(图3)。根据分泌颗粒的形态、大小和电子密度以及细胞形态学特点,可以区分出4种不同类型的内分泌细胞(表1)。4种内分泌细胞密切接触且集中分布。Ⅰ型内分泌细胞胞质内分泌颗粒多呈规整的圆形,电子密度高,大小不等,直径介于400～770 nm(图3A)。Ⅱ型内分泌细胞胞质内分泌颗粒形态差异较大,多呈卵圆形,少数呈两端粗大、中间细长的哑铃型,电子密度高,直径介于265～1 320 nm(图3B)。Ⅲ型内分泌细胞胞质内分泌颗粒呈圆形或卵圆形,中等电子密度,也有颗粒呈电子疏松的囊泡状,直径介于180～340 nm(图3C)。这3种细胞形态均为圆形或卵圆形。Ⅳ型内分泌细胞细胞形态不规则,有胞质突起,胞质内分泌颗粒呈圆形或卵圆形,颗粒类脂型或黏液型,电子密度低,直径介于510～1 280 nm(图3D)。

表1 4种胸腺内分泌细胞及其分泌颗粒的形态特征Table 1 Morphological characteristics of four types of thymic endocrine cells and their secretory granules

图3 余干乌骨鸡胸腺4种内分泌细胞的超微结构特征Fig.3 Ultrastructural characteristics of four types of endocrine cells in the thymus of Yugan black-bone fowlA:Ⅰ型内分泌细胞; B:Ⅱ型内分泌细胞; C:Ⅲ型内分泌细胞; D:Ⅳ型内分泌细胞(N:细胞核; G1:Ⅰ型内分泌颗粒; G2:Ⅱ型内分泌颗粒; G3:Ⅲ型内分泌颗粒; G4:Ⅳ型内分泌颗粒)A:Type Ⅰ endocrine cells; B:Type Ⅱ endocrine cells; C:Type Ⅲ endocrine cells; D:Type Ⅳ endocrine cells (N:Cell nucleus; G1:Type Ⅰ endocrine granule; G2:Type Ⅱ endocrine granule; G3:Type Ⅲ endocrine granule; G4:Type Ⅳ endocrine granule)

3 讨论

动物胸腺的主要功能是培养和选择T细胞,但其也能分泌多种激素或因子,包括胸腺素、胸腺生成素、胸腺体液因子和血清胸腺因子等,且胸腺的功能受到这些激素或因子的调控[11]。研究表明,在哺乳动物中胸腺的内分泌功能主要由上皮网状细胞完成,但在非哺乳动物中似乎并非如此。Cao等的研究显示,胸腺内含有多种细胞类型,包含淋巴细胞、巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞和肥大细胞[12]。李丕鹏等通过免疫组化染色和透射电子显微镜观察到蛇的胸腺中存在内分泌细胞,并能够分泌激素[7]。此外,李丕鹏对鱼、大鲵、蟾蜍、蛙、鸟类和鼠类等11种动物的胸腺和其他免疫器官进行了特殊组织化学染色和免疫组化染色研究,结果显示,胸腺内分泌细胞从两栖类动物开始出现,到爬行类动物数量达到高峰,随后在鸟类又有所下降,到哺乳类动物则消失[13]。Mishra等的研究表明,鸡胸腺中常驻内分泌细胞群在细胞化学上至少有3种不同的细胞群,即亲银细胞、嗜银细胞和APUD细胞[14]。由此推断,非哺乳动物中胸腺的内分泌任务不单由上皮网状细胞完成,还有内分泌细胞的参与。

构成机体内分泌细胞的最重要群体是APUD细胞。APUD细胞是一种能分泌胺和多肽类激素的内分泌细胞,与具有内分泌功能的神经细胞一起组成弥漫性神经内分泌系统(Diffuse neuroendocrine system,DNES)[15]。APUD细胞作为内分泌细胞的一员,遍布全身各处,目前已发现50余种,以脑和胃肠道最多,此外肺脏、呼吸道、泌尿道和生殖道等部位均有很多的APUD细胞存在[16,17],并且APUD细胞可分泌多种激素,其中肠道APUD细胞可分泌胃泌素、脑啡肽、生长抑素、血管活性肠肽、肠促胰酶素、肠高血糖素和神经降压素等激素以维持肠道的功能[18-20]。APUD细胞种类众多,主要通过分泌颗粒的数量、大小、形状、粒芯的致密度和宽度来判断和鉴别APUD细胞类型,分泌颗粒也是APUD细胞最具特征性的超微结构[7]。胸腺APUD细胞的特征是拥有致密的分泌颗粒,颗粒形态和肾上腺素能神经末梢内颗粒相似,多呈圆形或长椭圆形,也有少部分呈不规则形。根据本试验在透射电子显微镜观察到的超微结构特点,推测余干乌骨鸡胸腺中的内分泌细胞应为APUD细胞。

本试验通过透射电子显微镜在余干乌骨鸡胸腺内观察到4种类型的内分泌细胞,其中Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型细胞数量较多,细胞形态为圆形和椭圆形,而Ⅳ型细胞数量较少,细胞形态不规则。Oubre等运用免疫组化方法鉴定鸡胸腺神经内分泌细胞,发现其细胞形态以圆形和卵圆形居多,还有小部分有明显延展性的细胞[21]。该结果与本试验通过透射电子显微镜观察到的结果相符。方会娟等通过透射电子显微镜观察到分布于胸腺髓质的内分泌细胞与周围胸腺细胞紧密接触,并推测内分泌细胞通过细胞表面黏附分子直接与胸腺细胞产生相互作用,或分泌某些肽类物质以旁分泌的形式参与调控胸腺细胞的分化和成熟[5]。本试验观察到的4种内分泌细胞同样与周围胸腺细胞紧密接触。李玉谷等[6]通过透射电子显微镜在粤黄鸡胸腺中发现3种形态不同的内分泌细胞,而本试验在余干乌骨鸡中发现了4种,且2个品种鸡的内分泌细胞形态有明显的不同。余干乌骨鸡胸腺中的内分泌细胞分泌颗粒直径较粤黄鸡的更长。余干乌骨鸡Ⅰ型内分泌细胞分泌的颗粒在超微结构和电子密度上与分泌激素的颗粒类似,因此,推测Ⅰ型内分泌细胞可能通过其分泌颗粒释放激素。Ⅱ型内分泌细胞可观察到两端粗大、中间细长的哑铃型颗粒,在之前的胸腺内分泌研究中未观察到这种特殊形态的分泌颗粒。Ⅱ型内分泌细胞虽然在形态上与一般细胞有差异,但其电子密度与Ⅰ型内分泌细胞类似,因此,推测Ⅱ型内分泌细胞可能分泌与Ⅰ型内分泌细胞不同的激素。本试验还发现,Ⅲ型内分泌细胞与Ⅰ型和Ⅱ型内分泌细胞的形态相似,但分泌颗粒较小且电子密度较低,推测Ⅲ型细胞可能为已完成分泌任务的内分泌细胞。余干乌骨鸡Ⅳ型内分泌细胞分泌颗粒呈圆形或卵圆形,浅灰色,颗粒类脂型或黏液型,胞质不规则,有明显的延伸性,而岭南黄鸡胸腺中未观察到这种类型的细胞[6]。基于Ⅳ型内分泌细胞分泌颗粒的电子密度比其他3种类型细胞小,呈类脂状或黏液型,推测其功能为分泌脂溶性激素或分泌黏液。本试验结果进一步表明,内分泌细胞分泌颗粒的形态特征不仅与动物的物种有关,同一物种不同品种的内分泌细胞分泌颗粒形态也可能不同。本试验根据细胞形态和分泌颗粒的异质性,发现余干乌骨鸡胸腺含有4种类型的内分泌细胞。