D3基因在抗病防卫反应中的转录调控研究

徐 悦,汪少敏,谭晓菁,罗英杰,常婧一,邓 会,刘秀丽,崔维军,周 洁,吴月燕,严成其,4,*,王栩鸣,*

(1.浙江万里学院 生物与环境学院,浙江 宁波 315100; 2.浙江省农业科学院 病毒学与生物技术研究所,农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,浙江 杭州 310021; 3.余姚市农业技术推广服务总站,浙江 余姚 315400; 4.宁波市农业科学研究院,浙江 宁波 315100)

水稻是我国的主要粮食作物之一,水稻在其生长发育过程中通常会受到各种病原物的侵害,例如细菌性病害白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae),真菌性病害稻瘟病菌(Magnaportheoryzae),水稻虫害褐飞虱(Nilaparvatalugens)、灰飞虱(Laodelphgaxstriatellus)等。其中最为常见的当属水稻白叶枯病,相关研究显示,白叶枯病自20世纪30年代被发现以来,随着南繁北调,水稻白叶枯病菌的侵染程度逐年增大,严重时还会导致绝收[1]。在20世纪90年代,由于抗性品种的推广,白叶枯病曾经一度得到较好的控制。但是由于气候、耕作条件等的变化,近年来白叶枯病发病率也在逐渐加重,造成的经济损失也在不断扩大[2],近几年在宁波地区,特别是余姚地区,该病害发病尤为严重[3]。对水稻白叶枯病的预防与控制手段主要包括栽培方式调整、化学生物防治以及种植抗病品种[4]。最初该病害防治手段主要是依赖于对发病位置和发病率的记载,然后通过焚烧稻茬、隔离病原物、控制施肥量等方法减少发病率[5],但上述方法会对环境造成较大影响。自1950年以来,农业生产开始采取喷洒农药来防治病害,并取得了一定的防效,但农药的不当使用,同样也会造成生态环境污染,另一方面还会导致谷物农药残留、稻米的品质下降以及食品安全等一系列问题[6]。目前普遍认为,推广和种植抗病水稻品种,使其利用自身防御系统达到抗病的目标,是防治水稻白叶枯病最经济有效的方法。

植物体内存在两种应对病原菌入侵的免疫防御机制,分别为广谱免疫防御(pathogen-associated molecular patterns triggered immunity, PTI)和特异性免疫防御(effector-triggered immunity, ETI)[7]。PTI是指病原相关的分子模式激发的免疫反应,主要是由多糖、鞭毛蛋白等引起的非特异性免疫;而ETI是由效应蛋白引起的特异性免疫反应。在研究植物免疫过程中,研究者发现植物激素同样广泛参与植物的抗病过程[8],包括水杨酸(salicylic acid, SA)[9]、茉莉酸(jasmonic acid, JA)[10]、独脚金内酯(strigolactones, SL)[11]等。其中SL是一种近几年被证明的新型植物激素,它主要参与植物的枝条分蘖以及叶片衰老等生理过程。水稻作为一种多分蘖作物,其分蘖数直接影响水稻有效穗数及穗粒数,是决定水稻产量的“三要素”之一[12]。拟南芥中的MAX基因作用于SL信号转导过程,导致植物分枝增加[13],而我们所研究的D3基因与拟南芥的MAX2/ORE9蛋白为直系同源,并且都参与SL信号转导过程[14]。目前已经有多项研究鉴定并克隆了参与SL生物合成的关键基因,包括:D27[15]、D17[16]、D10[17]、OsMAX1s[15]及信号途径相关基因D3、D14[15]和D53[12]等。其中当SL存在时,D14与D3形成复合体,导致D53泛素化降解,激活下游基因的表达,从而抑制侧芽的生长[14],初步阐明SL调控水稻分蘖形成的分子机制。我们研究的水稻D3基因定位于细胞核内,在根、叶以及穗部表达丰度较高。D3基因共包含4个外显子,编码720个氨基酸[18]。相关报道表明,D3基因参与调控水稻的株形发育过程。Ishikawa等[19]研究表明,D3基因的突变株系和日本晴(OryzasativaL.japonica. cv. Nipponbare, Nip)相比植株表型具有显著差异,突变株系的植株矮小、分蘖增多,同时突变株系中的分生组织正常生成,但对分蘖芽的抑制作用被削弱。拟南芥MAX2/ORE9基因功能缺失突变株系在黑暗环境中叶片衰老过程延缓,作为直系同源的D3基因,突变水稻株系同样存在叶片衰老过程被减缓的现象[20]。研究表明,SL可以调控水稻分蘖,Choi等[21]进一步研究证实,D3与D14形成的D14-SCFD3复合体可以正调控SL信号转导过程,并通过降解被OsGSK2磷酸化修饰的CYCU2,进而抑制中胚轴的伸长。

目前,转录组学已经成为我们解析生物基因信息的一个技术手段[22]。转录组测序技术在水稻抗病研究中的应用颇为广泛。刘永振等[23]将转录组测序技术运用于水稻抗病和感病品种之间的分子机制上,证明了二代测序技术可以快速地测出不同品种之间基因序列差异情况。在水稻抗病研究中,对于D3基因在抗病过程中的功能研究较少。本研究采用转录组学对D3基因的编辑水稻株系进行了分析。通过检测水稻白叶枯病菌接种12 h内,不同时间点D3基因的表达情况,发现水稻白叶枯病菌侵染明显诱导D3基因的表达。水稻白叶枯病菌接种实验证实:D3基因的编辑水稻株系表现出较为明显的白叶枯病抗性。以上研究表明,D3基因很可能参与水稻抗病防卫过程,影响水稻对白叶枯病的抗性。

与水稻转基因遗传背景品种Nip相比,D3基因编辑株系在株高、分蘖等性状差异明显,且表现出白叶枯病抗性。经过基因组测序鉴定,我们成功获得了3个不同位点的基因编辑材料,不同敲除株系在株高发育方面有所差异,白叶枯病抗性也各不相同。本研究利用多蘖矮秆D3基因编辑材料(GEM1、GEM2、GEM3)进行了转录组分析,利用相关数据对D3基因在转录层面的调控机制进行探索,从中总结D3基因对于水稻抗白叶枯病的机制,明确其在抗病防卫反应中的作用,为将来创制抗病材料提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

植物材料:日本晴(本实验室保存);D3基因编辑转基因株系GEM1、GEM2、GEM3(本实验室创制):D3基因 CDS序列共2 163 bp,实验室利用CRISPR/Cas9技术分别在CDS序列111、1 524、2 045 bp处进行了基因编辑,根据突变位点不同将编辑株系分别命名为 GEM1、GEM2、GEM3[18]。

菌株:水稻白叶枯病菌(菲律宾P10小种,本实验室保存)。

水稻D3基因转录组分析材料:挑选颗粒饱满的水稻种子利用1/2 MS培养基进行培育发芽,之后使用营养液培养至2周苗龄,3组突变株系和对照组分别选取9株长势一致且良好的水稻第3叶进行取样,3株样品为一个处理组(表1)。

表1 D3基因编辑转基因GEM株系Table 1 D3 gene-edited transgenic GEM line

1.1.2 主要试剂

异丙醇(国药集团化学试剂有限公司 )、氯仿(Sigma-Aldrich);HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司);Trizol (Invitrogen)。

1.1.3 主要仪器

Centrifuge 5415R型和5417R型台式离心机(Eppendorf);GE4852T型PCR仪(杭州柏恒科技有限公司);5430R型低温高速离心机(Eppendorf);Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent)。

1.2 实验方法

1.2.1 白叶枯病菌接种实验

实验中使用的水稻白叶枯病菌 P10利用协本哲液体培养基在28 ℃条件下230 r·min-1摇床中进行活化培养,直至D600处于0.6～0.8。

选取14 d苗龄的对照组Nip进行白叶枯病菌接种,用蘸取菌液的剪刀在倒一叶离叶尖2 cm处进行实验,分别按照实验设计(0～12 h)进行每2 h取样一次,对样品进行叶片RNA提取、逆转录、qRT-PCR实验等。

D3基因编辑株系进行营养液培养至21 d后,选取长势一致的移入大田,水稻移栽2个月后对倒二叶进行白叶枯病菌接种实验,接菌14 d后,量取叶片病斑长度并计算均值,每组取与均值相近的病斑叶片5片用于拍照记录。

1.2.2 RNA提取与D3基因编辑材料文库构建

本实验采用Trizol法提取叶片总RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer等仪器对RNA降解程度、纯度、浓度等各方面进行检测。以片段化的mRNA为模板,逆转录合成cDNA。通过PCR扩增富集片段并选择450 bp片段,完成文库的构建。

1.2.3 转录组测序

通过Agilent 2100 Bioanalyzer对文库进行质量检测,利用荧光定量检测文库总浓度及有效浓度。将含有不同Index序列的文库按比例进行混合并稀释,委托派诺森生物科技有限公司利用第二代测序技术,基于Illumina测序平台,对文库进行高通量测序,后将各样本数据分别与水稻参考基因组序列进行比对并计算基因表达量。在此基础上,进一步对样品进行表达差异分析、GO (gene ontology, GO)分析[24]和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析[25]。通过HISAT2[26]对基因数据进行研究,利用DESeq对基因表达进行差异分析(差异倍数|log2FoldChange|>1),将显著性P<0.05的基因定义为差异表达基因(differential expressed genes, DEGs)。

1.2.4 差异表达基因的qRT-PCR验证

为验证转录组数据准确性,我们选取5个DEGs进行qRT-PCR定量分析。利用Premier 5.0软件(PREMIER Biosoft)设计qRT-PCR引物,内参基因选用β-actin(β肌动蛋白),引物序列详见表2。仪器为 Light Cycler 480 Real-Time PCR仪(Roche)。

表2 qRT-PCR的引物序列Table 2 Primers used for qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 水稻D3基因编辑株系的抗病分析

为了确定水稻白叶枯病菌是否会改变D3基因的表达,本实验对Nip进行倒一叶白叶枯病菌接种实验。依据实验数据分析水稻白叶枯病菌接种12 h内不同时间点D3基因表达情况。实验结果显示,水稻白叶枯病菌侵染明显诱导D3基因的表达(图1),并且在10 h基因表达量达到最高值。

图1 D3基因在不同时间点受Xoo诱导的表达量Fig.1 The expression levels of the D3 gene induced by Xoo at different time points

根据以上结论,我们对T3代D3基因编辑纯合株系进行白叶枯病菌接种实验。病斑结果显示,D3基因编辑纯合株系均表现出一定的白叶枯病抗性(图2)。据上述结果,我们推测D3基因可能参与调控水稻白叶枯病防卫反应。

图2 编辑株系和日本晴的病斑表型对比图Fig.2 Edit plots of disease spot phenotypes between lines and Nip

2.2 测序数据质量分析

实验结果显示,对照组与D3基因编辑处理组的3个生物学重复中任意两个样本R2均大于0.98,这表明生物学重复性好、数据可靠。此外,我们比较不同编辑株系间的基因表达相关性,发现对照组与处理组之间的平均R2均低于组内生物学重复,说明基因编辑处理组的基因表达与对照组之间存在一定差异,进一步表明D3基因编辑过程中确实导致了基因转录水平表达的改变。综合实验组与对照组的样本基因表达分析,共检测到8 184个基因发生差异表达,在3组处理中均呈现差异表达的相关基因共有359个(图3-A)。其中,GEM2的DEGs较少,GEM3的DEGs较多(图3-B)。为了验证转录组测序结果的可靠性,我们选取5个DEGs (P<0.05)进行了qRT-PCR验证。结果显示:各DEGs的测定结果与转录组数据的变化趋势基本一致(图3-C)。

A, 基因编辑组之间差异基因的韦恩图;B,基因编辑组之间的差异表达基因数;C,基因编辑组与对照组之间差异基因相对表达量的qRT-PCR分析。A, Venn diagrams of differentially expressed genes among the gene editing groups and the control group; B, Numbers of differentially expressed genes among the gene editing groups and the control group; C, qRT-PCR analysis of relative expression levels of differentitally genes among the gene editing groups and the control group.图3 样本间关系的整体特征Fig.3 Overall characterization of sample relationship

测序结果显示,3个编辑处理都成功改变了目标位置的基因组序列。根据编辑后的序列推测,D3基因编辑水稻株系不再表达完整的D3基因。通过表型观察发现:与对照组日本晴相比,D3基因编辑株系均呈现多蘖矮秆的性状,其中GEM3表现出多蘖矮秆性状最为明显;3种株系相比,表型也存在一定差异,推测这种差异源于不同的突变模式导致D3基因功能缺失的差异。编辑株系GEM2中缺失的3个碱基是位于D3基因CDS序列的中段,缺失三联体密码导致单个氨基酸的缺失,未改变后续氨基酸的顺序,导致GEM2编辑水稻株系的表型与对照组相比没有显著变化。GEM3编辑水稻株系缺失8个碱基,使编辑水稻株系性状发生明显变化,例如植株矮小、分蘖增多;同时转录组数据也显示DEGs数量最多。上述结果表明:较长片段的缺失可以显著改变D3基因的功能表达。

2.3 水稻差异表达基因GO分析

通过topGO[24]对筛选获得的差异表达基因进行GO富集分析,进一步研究了不同编辑水稻株系中DEGs的主要生物学功能。对富集到的所有层级的GO项进行显著性分析,共有10项生物过程,9项细胞组分,13项分子功能相关的GO terms获得富集(图4)。细胞组分分析结果显示,不同基因编辑水稻株系较对照组在细胞膜、泛素连接酶复合体及质外体等细胞组分上显著(P<0.05)富集,其中细胞膜在GEM3中最为显著,并且上调表达的DEGs居多;同样,泛素连接酶在GEM3中富集程度相对较高。由于E3泛素化是植物体内一种广泛存在的细胞反应调控机制,主要参与调控植物抗病反应[27],而GEM3呈现出的白叶枯病表型最为明显(图2)。生物学过程分析结果显示,蛋白泛素化及蛋白磷酸化的GO条目在GEM1和GEM2中显著富集,RNA代谢过程和含核碱基化合物代谢过程在GEM2和GEM3中显著富集。分子功能分析结果显示,转移酶活性在GEM2、GEM3中显著富集。

差异表达显著的基因被总结为3个主要的GO类别(细胞成分、生物过程和分子功能)。橙色为上调,绿色为下调。These genes with significant difference are summarized into three main GO categories (biological processes, molecular function, and cellular components). Orange is the up regulated, green is the down regulated.图4 对差异表达显著的DEGs的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs with significant expression difference

2.4 水稻差异表达基因KEGG分析

通过对D3基因编辑水稻株系的DEGs进行KEGG代谢途径富集分析,1 145个DEGs参与到290个KEGG途径。其中16个KEGG代谢途径富集结果显著(P<0.05)(图5),分别为次生代谢产物生物合成相关的苯丙烷生物合成途径、类黄酮生物合成途径;信号转导相关的植物激素信号转导、植物MAPK信号途径。苯丙烷生物合成途径在GEM1和GEM3中显著富集,在GEM1和GEM3中,分别有13个和19个DEGs参与植物MAPK信号传导过程。此外,植物病原菌互作在GEM2中明显富集,类胡萝卜素生物合成、油菜素类固醇生物合成等KEGG通路同样富集明显。据相关报道,上述相关KEGG途径均与植物抗病过程密切相关[28]。

圆圈的大小代表在相应途径中富集的DEG数量,圆圈的颜色代表相应路径。The size of the circle represents the number of DEG enriched in the corresponding pathway, and the color of the circle represents the corresponding pathway.图5 基因编辑处理组与对照组之间差异表达基因的KEGG富集途径分析Fig.5 KEGG enrichment pathway analysis of differentially expressed genes among gene editing treatment groups and control group

2.5 苯丙烷生物合成途径差异表达基因

苯丙烷生物合成途径是植物重要的次生代谢途径之一,在植物的生长发育及应对逆境胁迫中发挥着重要作用,大多数植物的次生代谢产物来源于苯丙烷代谢途径,如木质素、类黄酮、花青素等[29]。通过KEGG分析注释得到7个DEGs参与苯丙烷生物合成途径(图6),主要富集于苯丙烷生物合成途径、类黄酮生物合成途径等次生代谢途径。其中,过氧化物酶前体相关基因在GEM1中有4个显著上调表达;在GEM2中有1个上调表达、其余3个下调表达;在GEM3中有4个显著下调表达,这一结果与过氧化物酶的活性会随着抗病性的降低而显著升高的结论保持一致[30]。植保素(phytoalexin, PA)是植物受到病原菌侵袭时,在宿主体内合成并积累的低分子量抗菌性物质[31]。前人研究表明,敲除水稻苯丙烷合成途径中的苯丙氨酸氨裂合酶能够减少水稻植保素的合成,导致植株的抗病性减弱[32]。在GEM1和GEM2基因编辑水稻株系中苯丙烷生物合成途径相关基因Os04g0518400的表达显著下调,而在GEM3中上调表达。因此,我们推测D3基因可能通过影响植物次生代谢途径中的苯丙烷生物合成,调控水稻抗病反应。

图6 苯丙烷生物合成途径中基因编辑处理组与对照组之间差异表达基因分析Fig.6 Analysis of differentially expressed genes among gene editing treatment groups and control group in the phenylpropane biosynthetic pathway

2.6 植物-病原菌互作差异表达基因

植物与病原菌的相互作用是植物适应环境的重要途径之一,与抗病蛋白、钙调蛋白等抗病化合物的合成相关。抗病蛋白RPM1是一种植物免疫受体,在拟南芥中特异性识别病原体释放的效应物,激活效应因子触发的免疫反应,并引发超敏反应[33]。此外,Ca2+是植物生长发育所必需的矿物质元素,参与协调植物生长发育过程和逆境信号转导过程[34]。根据KEGG途径富集结果显示,与对照组相比,植物-病原菌互作途径相关基因在3个D3基因编辑水稻株系均呈显著差异表达(图7)。其中参与抗病蛋白调控的Os01g0788500在GEM3中呈上调表达;参与Ca2+

图7 植物病原菌互作中基因编辑处理组与对照组之间差异表达基因分析Fig.7 Differentially expressed gene analysis among gene editing treatment groups and control group in plant pathogen interactions

调解的EF hand家族[35]相关基因Os05g0577500在GEM3中下调表达。结合D3基因编辑水稻株系对白叶枯病菌所表现出的抗性表型,进一步说明D3基因的确参与了水稻抗病防卫反应。

2.7 信号转导途径差异表达基因

植物激素信号转导参与调控植物免疫反应,多种抗病基因参与植物激素信号转导以及合成蛋白激酶。根据GO及KEGG分析,在D3基因编辑水稻株系中植物激素信号转导过程变化明显。在植物信号通路中,共发现16个功能较为明确的DEGs,其中包括5个蛋白激酶、3个生长素信号转导、2个脱落酸信号转导、2个bZIP转录因子、2个TIFY家族基因(JAZ)和JA-诱导型碱基螺旋-环-螺旋转录因子(MYC)等相关基因(图8)。

图8 信号转导途径中基因编辑处理组与对照组之间差异表达基因分析Fig.8 Analysis of differentially expressed genes among gene editing treatment groups and control group in signal transduction pathways

研究表明,属于腺嘌呤衍生物的细胞分裂素(cytokinin, CTK)[36]及油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)[37]均在植物生长发育过程中起重要作用。细胞分裂素是参与调控水稻分蘖的另一种激素,细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(cytokinin oxidase, CKX)是唯一一种专一催化天然异戊烯类CKs及其核苷的不可逆降解酶,是控制植物细胞分裂程度的重要因子[38];作为一种植物激素,油菜素内酯通过精细调节植物体内激素含量变化调控植物生长发育并适应环境[39]。Nakashita[40]研究表明,油菜素甾醇能够提高水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。另有研究显示:通过降低OsSERK2基因表达量,可以抑制水稻对白叶枯病的抗性[41]。在处理组与对照组之间的与BR信号激酶(GO:0006468)相关的差异表达基因中,SERK家族相关基因Os07g0622000等抗病基因在GEM2、GEM3中均上调表达。

目前水稻中已成功克隆的抗病基因大多属于类受体蛋白激酶,直接参与对病原菌的识别和防御,与防御相关转录因子WRKY、AP2/ERF以及MAPK信号级联等相关。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应是植物基础免疫的重要组成部分,属于植物中高度保守的信号转导模块[42]。根据转录组数据分析,D3基因敲除株系中MAPK信号传导途径有大量基因差异表达,如OsSAPK7的相关基因Os04g0432000在GEM3中显著上调,这一结果与GEM3的表型一致,当水稻受到细菌性病菌侵染后,OsSAPK7基因的表达显著上调[43]。这表明D3基因可能参与抗逆胁迫生理反应并与MAPK级联反应相关进而调控植物抗病防卫过程。

3 结论

水稻抗病材料的研究不仅能提供重要的抗病基因资源,提高水稻对病害侵袭的防御能力,还能减少农药的使用量,直接关系到食品安全以及绿色农业的可持续发展。利用抗性基因资源进行育种既保证了粮食安全,降低病害对水稻产量的危害,同时也减少了农药滥用对生态环境的破坏,为农业生产的可续发展提供切实可行的措施。

本研究对3个D3基因编辑水稻株系和野生型日本晴进行了转录组分析,共鉴定出8 184个DEGs,在3个编辑水稻株系中均呈现差异表达的相关基因有359个。实验中D3基因在进行CRISPR/Cas9编辑处理后得到3种不同突变类型的基因编辑水稻株系(GEM1、GEM2、GEM3)。水稻差异基因表达分析结果显示,与对照组相比,GEM2组DGEs数目最少,而GEM3组DEGs数目最多。GEM3编辑水稻株系表现出明显的表型变化(株高变矮,分蘖增多),转录组数据显示其DGEs数量最多,这表明较长片段缺失能够显著改变D3基因功能,进而明显地影响水稻的株高及分蘖等发育表型。

我们分别从GO功能富集分析、KEGG生物途径富集分析进行数据挖掘,阐释水稻与白叶枯病菌株互作的分子机制。根据水稻差异表达基因的GO分析,3个编辑水稻株系较对照组在细胞组分(细胞膜、泛素连接酶复合体、质外体等)、分子功能(转移酶活性)及生物学过程中分别发生显著差异表达。WRKY、DUF26等类受体蛋白激酶在PTI过程中起到跨膜识别病原菌相关分子模式的作用,而此类激酶在上述3组处理组中均有显著差异表达。GO分析显著富集在细胞膜组分、泛素连接酶复合体和质外体上,说明D3基因编辑水稻株系较对照组在水稻细胞膜组分及质外体中的分子互作异常活跃,推测类受体蛋白激酶能在细胞膜及质外体空间上识别病原菌相关分子模式,并发挥信号传导作用,促使植物体对环境胁迫作出适应性反应。苯丙烷生物合成途径、植物MAPK信号传导途径及植物激素信号转导等KEGG通路在3个编辑水稻株系中均有显著富集,表明D3基因可能参与抗逆胁迫生理反应,并通过MAPK级联反应调控植物抗病防卫过程。

通过转录组从转录水平上解析D3基因突变模式及位置效应所带来的表型差异,探究D3基因在抗病防卫反应中的作用机制,不仅丰富了植物抗病分子基础信息,同时也为我们通过CRISPR/Cas9技术提高水稻抗病性及创制水稻抗病种质资源提供理论依据。