科学家成功构建胚胎干细胞嵌合体猴

[本刊讯] 由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心刘真研究组、脑智卓越中心非人灵长类研究平台孙强研究团队和中国科学院广州生物医药与健康研究院M. A. Esteban研究组合作，首次成功构建高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴，并证实猴胚胎干细胞可高效地贡献到胚外胎盘组织和生殖细胞。这对理解灵长类胚胎干细胞的全能性具重要意义，为遗传修饰模型猴的构建奠定了基础。成果以“高比例胚胎干细胞贡献的出生存活嵌合体猴”为题，于2023年11月9日以封面文章形式发表在《细胞》（Cell）上。

胚胎干细胞是指由着床前囊胚的内细胞团在体外分离培养而来的多能性细胞，在模式动物构建、细胞治疗、器官再生、类器官模型等领域有重要作用。它有体外无限自我复制更新、诱导实现多向分化、胚胎注射形成嵌合体等关键特征，其中胚胎注射形成嵌合体是评估胚胎干细胞多向分化潜能的金标准。之前已实现小鼠、大鼠胚胎干细胞胚胎注射形成嵌合体，但非人灵长类胚胎干细胞嵌合体研究一直进展缓慢。

为获得具有高效发育潜能的胚胎干细胞。研究者建立了6种不同培养体系下的食蟹猴胚胎干细胞，从克隆形态、免疫荧光、单细胞转录组、线粒体代谢、全基因组甲基化、核型分析和全基因组测序等方面，对它们进行全面系统的评估。发现5iLAF、4CL和PXGL体系下的食蟹猴胚胎干细胞具有较高多能性，且4CL体系下的干细胞具有更好的传代稳定性和基因组稳定性。

胚胎干细胞注射入受体胚胎后的快速凋亡是影响胚胎干细胞成功嵌合的关键。研究者选用绿色荧光蛋白标记的4CL条件下的胚胎干细胞进行猴胚胎注射，通过测试干细胞注射入胚胎后的不同培养基和培养时间的组合，得到既不影响胚胎正常发育，又能保证干细胞存活的最优嵌合胚胎培养条件。5iLAF、Primed体系下的胚胎干细胞在该优化条件下也表现出胚胎注射后的高存活率。将注射了4CL和5iLAF干细胞的嵌合胚胎分别在体外延迟培养到第17天，发现注射的胚胎干细胞仍可高效存活，单细胞测序表明猴胚胎干细胞可与受体胚胎细胞同步发育，且贡献到第17天猴胚胎的不同细胞谱系中。

在系统性评估不同培养条件下，猴胚胎干细胞状态和改进优化了嵌合胚胎培养条件的基础上，研究者将注射了绿色荧光标记的4CL干细胞的胚胎移植到代孕母猴内。在一只出生存活猴和一只流产猴中检测到胚胎干细胞的嵌合。通过一系列嵌合体分析流程，发现出生存活猴中胚胎干细胞的贡献比例高达70%，流产猴中胚胎干细胞的贡献比例约20%。单细胞转录组测序也表明注射的胚胎干细胞可以与受体胚胎细胞同步分化到出生个体猴的各种不同细胞谱系中。

胎盘组织和生殖细胞是胚胎发育和重编程过程中两类特殊组织和细胞。胎盘组织由滋养外胚层发育而来，而生殖细胞在发育过程中要经历更加剧烈的表观重编程。研究者在两只嵌合体猴的胎盘组织中均发现了胚胎干细胞的高比例贡献。考虑到小鼠胚胎干细胞几乎不会贡献到胎盘组织，该结果说明灵长类胚胎干细胞可能具有不同于啮齿类的独特的发育全能性特征。此外，两只嵌合体猴的生殖细胞中也发现了胚胎干细胞的高比例贡献，这对后续基于该技术的遗传修饰模型构建至关重要。

该工作建立了系统评估不同培养条件下，猴胚胎干细胞多能性状态的研究体系，并探索得到有利于胚胎干细胞存活的胚胎嵌合体的培养条件，显著提升了胚胎干细胞注入胚胎后的存活效率，最终得到出生存活的高比例胚胎干细胞贡献的嵌合体猴，证实注入的猴胚胎干细胞可高效贡献到包括胎盘和生殖细胞在内的各种不同组织和细胞。这對于理解灵长类胚胎干细胞全能性和发育潜能具有重要意义，为建立基于猴胚胎干细胞嵌合体的基因打靶和模型构建技术奠定了基础。

该研究严格遵守生物伦理规范，所有实验均符合国际干细胞研究学会的研究指南，并经脑智卓越中心伦理委员会审核。

（晓 工）