附子的化学成分研究（Ⅱ）

2024-01-02陈靖

现代中药研究与实践 2023年4期

陈靖

（常德职业技术学院药学系，湖南常德 415000）

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，始载于《神农本草经》。附子辛、甘，大热，有毒。归心、肾、脾经。有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效[1]。附子从古至今在临床上都有广泛使用，如医圣张仲景、中医火神派创始人郑钦安都以善用附子而闻名。但附子有毒，如果应用不当，容易出现严重的毒副作用，为确保临床用药安全，我国制定了包括毒性药在内的特殊药品管理办法。现代研究表明，附子的毒性成分大多来源于二萜类生物碱，但二萜类生物碱不仅只表现为毒性，也是附子其功效的关键成分，表现出了良好的抗炎、镇痛、抗心律失常和抗肿瘤等作用[2]。20 世纪60 年代以来，研究人员对附子的研究从未中断，附子的成分复杂，因此对其进行化学成分研究仍然具有重要的意义。通过前期研究，分离了6 个二萜类化合物[3]，本文在此基础上继续对附子进行化学成分研究，为进一步探讨附子的药效物质基础及质量评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

附子由四川江油道地产区提供，经常德职业技术学院药学系刘宏伟教授鉴定为乌头属植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的子根，标本存放于常德职业技术学院药学系；薄层层析和柱层析用硅胶（200 ～ 300 目，硅胶H，青岛海洋化工厂）；薄层层析和柱层析用聚酰胺（100 ～ 200 目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia 公司）； XT-4 型显微熔点测定仪（上海荆和分析仪器有限公司）； Bruker ACF-500 型核磁共振仪（TMS 为内标）（德国 Bruker 公司）； TOF/MS（美国安捷伦科技公司, ESI Mode）；实验所用试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

取46.0 kg 干燥附子药材，分别用四倍量95%乙醇回流提取3 次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂得到浸膏3.4 kg，2%盐酸水溶液溶解，氯仿萃取。其中，氯仿部位浸膏330 g 经硅胶柱层析（200 ～ 300目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 : 1 ～ 1 : 1），经TLC检测合并相似流分，得到A1 ～ A4。A1 经过反复硅胶柱层析（200 ～ 300 目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 :1 ～ 1 : 1），经Sephadex LH-20（甲醇）反复纯化，得到化合物2（9 mg）和化合物3（10 mg）；A2 经反复硅胶柱层析（200 ～ 300 目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 :1 ～ 1 : 1），经Sephadex LH-20（甲醇）反复纯化，得到化合物4（8 mg）；A3 经反复硅胶柱层析（200 ～300 目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 : 1 ～ 1 : 1），经Sephadex LH-20（甲醇）反复纯化，得到化合物9（4 mg）；A4 经反复硅胶柱层析（200 ～ 300 目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 : 1 ～ 1 : 1），经Sephadex LH-20（甲醇）反复纯化，得到化合物1（13 mg）。

将酸水液用氨水调pH 至9 ～ 10 后，用氯仿萃取得氯仿部位浸膏70 g，经硅胶柱层析（200 ～ 300 目）氯仿-甲醇梯度洗脱（100 : 1 ～ 1 : 1），经TLC 检测合并相似流分，得到B1-B3。B1 经反复硅胶柱层析（200 ～ 300 目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 : 1 ～1 : 1）后析出化合物5（ 7 mg）；B2 经反复硅胶柱层析（200 ～ 300 目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 : 1 ～ 1 :1），经Sephadex LH-20（甲醇）反复纯化，得到化合物7（5 mg）和化合物8（4 mg）；B3 经反复硅胶柱层析（200 ～ 300 目），氯仿-甲醇梯度洗脱（100 :1 ～ 1 : 1），经Sephadex LH-20（甲醇）反复纯化，得到化合物6（6 mg）。

2 结构鉴定

化合物1：白色粒状结晶 (CH3COCH3)，m.p.208 ～210 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOF-MSm/z604.312 8 [M+H]+，分子式为C32H45NO10；1H-NMR(CDCl3, 500 MHz) δ: 8.04 (2H, brd,J=7.2 Hz, H-2',6')，7.55 (1H, brt,J=7.2 Hz, H-4')，7.45 (2H, brt,J=7.2 Hz, H-3', 5')，4.98 (1H, d,J=5.0 Hz, H-14)，4.76 (1H, d,J=5.0 Hz, H-15)，4.27 (1H, d,J=4.4 Hz, HO-15)，4.24(1H, brd,J=6.3 Hz, H-6)，3.79 (1H, d,J=8.5 Hz, H-3)，3.73 (3H, s, 16-OCH3)，3.55 (1H, m, H-18a)，3.37 (3H, s,6-OCH3)，3.32 (3H, s, 1-OCH3)，3.28 (3H, s, 18-OCH3)，3.15 (1H, d,J=5.0, H-16)，3.11 (1H, m, H-18b)，3.00 (1H, d,J=5.0 Hz, H-1)，2.89 (1H, s, H-17)，1.41 (3H, t,J=5.2 Hz,Et-N)；13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 81.2 (C-1)，30.8(C-2)，70.1 (C-3)，43.3 (C-4)，48.2 (C-5)，81.1 (C-6)，43.7 (C-7)，78.1 (C-8)，43.8 (C-9)，40.5 (C-10)，49.9(C-11)，35.4 (C-12 )，74.3 (C-13)，78.5 (C-14)，79.9(C-15)，90.5 (C-16)，64.5 (C-17)，77.5 (C-18)，50.4(C-19)，55.1 (1'-OCH3)，58.0 (6'-OCH3)，60.6 (16'-OCH3)，59.2 (18'-OCH3)，10.8 (N-CH2CH3)，49.9 (N-CH2CH3)，166.4， 129.8，129.9×2，128.5×2，133.1 (C-14'-OBz)。以上数据与文献[4]报道基本一致，故鉴定该化合物benzoylaconine。

化合物2：白色粒状结晶 (CH3COCH3)，m.p.205 ～206 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOFMSm/z590.297 4 [M+H]+，分子式为C31H43NO10；1H-NMR（ CDCl3, 500 MHz） δ: 8.05 (2H, brd,J=7.5 Hz,H-2', 6')，7.54 (1H, brt,J=7.5 Hz, H-4')，7.44 (2H, brt,J=7.5 Hz, H-3', 5')，4.98 (1H, d,J=5.0 Hz, H-14)，4.82(1H, d,J=5.0 Hz, H-15)，4.26 (1H, d,J=5.0 Hz, HO-15)，4.11 (1H, brs, HO-13)，3.96 (1H, brd,J=8.3 Hz, H-6)，3.71(3H, s, 16-OCH3)，3.58 (1H, t,J=7.0 Hz, H-3)，3.51 (1H,d,J=5.5 Hz, H-18b)，3.46 (3H, s, 6-OCH3)，3.39 (3H, s,1-OCH3)，3.34 (1H, d,J=7.5 Hz, H-9)，3.30 (3H, s,18-OCH3)，3.22 (1H, d,J=8.5 Hz, H-16)，3.14 (1H,d,J=5.5 Hz, H-18a)，3.06 (1H, s, H-17)，2.57 (1H, d,J=6.5 Hz, H-19a)，2.13 (1H, d,J=6.5 Hz, H-19b)。以上数据与文献[4]报道基本一致，故鉴定该化合物为benzoylmeaconine。

化合物3：白色粒状结晶 (CH3COCH3)，m.p.126 ～ 128 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOF-MSm/z574.302 8 [M+H]+，分子式为C31H43NO9；1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.05 (2H, brd,J=7.5 Hz,H-2', 6')，7.54 (1H, brt,J=7.5 Hz, H-4')，7.44 (2H, brt,J=7.5 Hz, H-3', 5')，4.96 (1H, d,J=5.0 Hz, H-14)，4.80(1H, d,J=5.0 Hz, H-15)，4.24 (1H, m, HO-15)，4.05 (1H,brs, HO-13)，3.85 (1H, brd,J=8.5 Hz, H-6)，3.73 (3H, s,1-OCH3)，3.48 (3H, s, 6-OCH3)，3.44 (3H, s, 1-OCH3)，3.28 (3H, s, 18-OCH3)，3.134 (1H, s, H-17)，2.56 (1H,d,J=6.0 Hz, H-19a)，2.18 (1H, d,J=6.0 Hz, H-19b)。以上数据与文献[5]报道基本一致，故鉴定该化合物为benzoylhyaconine。

化合物4：白色粉末，m.p.161 ～ 164 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOF-MSm/z618.328 3[M+H]+，分子式为C33H47NO10；1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.03 (2H, brd,J=8.0 Hz, H-2', 6')，7.55 (1H,brt,J=8.0 Hz, H-4')，7.44 (2H, brt,J=8.0 Hz, H-3', 5')，4.81 (1H, d,J=5.5 Hz, H-14)，4.54 (1H, dd,J=5.5 Hz,1.4, H-15)，4.07 (1H, brd,J=5.5 Hz, H-6)，3.76 (1H,m, H-3)，3.73 (3H, s, 16-OCH3)，3.61 (2H, q,J=6.5 Hz,H-8')，3.56 (1H, d,J=8.0 Hz, H-18b)，3.51 (1H, m, H-16)，3.31 (3H, s, 6-OCH3)，3.28 (3H, s, 1-OCH3)，3.27 (3H, s,18-OCH3)，3.25 (1H, d,J=8.0 Hz, H-18a)，3.12 (1H, dd,J=8.5 Hz, 6.0, H-1)，2.93 (1H, s, H-17)，2.80 (1H, s, H-7)，2.77 (1H, dd,J=7.5 Hz, 5.0, H-9)，2.32 (3H, s, N-CH3)，1.91 (1H, d,J=5.5 Hz, H-5)，0.58 (3H, t, q,J=6.5 Hz,H-8'')；13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 85.1(C-1)，35.9(C-2)，70.0 (C-3)，42.7 (C-4)，46.3 (C-5)，83.7 (C-6)，44.9 (C-7)，84.1 (C-8)，44.0 (C-9)，42.5 (C-10)，51.6(C-11)，38.4 (C-12)，74.3 (C-13)，81.3 (C-14)，78.5(C-15)，95.7 (C-16)，63.5 (C-17)，76.4 (C-18)，50.4(C-19)，56.3 (C-1')，59.0 (C-6')，62.3 (C-16')，59.2 (C-18')，46.9 (N-Me)，57.8，15.7 (C-8')，168.1，129.8，130.9×2，129.4×2，134.1 (C-14'-OBz)。以上数据与文献[6]报道基本一致，故鉴定该化合物为8-OEt-14-benzoylmesaconine。

化合物5：白色簇状结晶 (CH3COCH3)，m.p.145 ～ 146 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOF-MSm/z422.290 2 [M+H]+，分子式为C24H39NO5；1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 4.79 (1H, brs, H-14)，4.25 (1H, brs, H-6)，4.13 (1H, brs, H-16)，3.92 (1H,brs, HO-8)，3.36 (3H, s, 16-OCH3)，3.36 (3H, s, 18-OCH3)，3.29 (3H, s, 1-OCH3)，3.06 (1H, brs, H-17)，1.06(3H, t,J=6.5 Hz, Et-N)；13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ:81.8 (C-1)，25.2 (C-2)，38.1 (C-3)，39.4 (C-4)，46.0(C-5)，24.5 (C-6)，44.7 (C-7)，73.4 (C-8)，45.7 (C-9)，38.6 (C-10)，49.1 (C-11)，27.8 (C-12)，44.9 (C-13)，75.0 (C-14)，39.7 (C-15)，81.4 (C-16)，62.0 (C-17)，80.3 (C-18)，53.5 (C-19)，56.0 (C-1')，56.5 (C-16')，59.4 (C-18')，13.7 (N-CH2CH3)，49.9 (N-CH2CH3)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定该化合物为talatizamine。

化合物6：白色粉末 (CH3COCH3)，m.p.155 ～156 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOFMSm/z394.259 4 [M+H]+，分子式为C22H35NO5；1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 5.16 (1H, d,J=4.5 Hz,H-15)，4.81 (1H, s, HO-15)，4.71 (1H, d,J=7.5 Hz,H-16)，4.34 (1H, t,J=9.0 Hz, H-6)，4.31 (1H, m, HO-1)，4.26 (1H, m, HO-6)，4.06 (1H, m, H-1)，3.97 (1H,s,H-20)，3.74，3.62 (2H, d,J=12 Hz, H-17)，3.69 (1H, d,J=3.0 Hz, HO-17)，1.27 (3H, t,J=7.0 Hz, CH3CH2-N)，0.76 (3H, s, H-18)；13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ:69.1 (C-1), 27.1 (C-2)，22.6 (C-3)，34.2 (C-4)，51.7(C-5)，67.3 (C-6)，44.2 (C-7)，49.9 (C-8)，36.4 (C-9)，53.4 (C-10)，20.2 (C-11)，29.7 (C-12)，42.3 (C-13)，42.1 (C-14)，83.9 (C-15)，78.5 (C-16)，67.4 (C-17)，49.9 (C-18)，55.0 (C-19)，66.5 (C-20)，51.8 (C-21)，10.0 (C-22)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定该化合物为chuanfumine。

化合物7：透明沙状结晶 (CH3COCH3)，m.p.257 ～ 259 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOF-MSm/z330.206 9 [M+H]+，分子式为C20H27NO3；1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 4.89 (1H, s, H-17a)，4.73 (1H, s, H-17b)，4.28 (1H, d,J=8.5 Hz, H-20)，4.17 (1H, t,J=2.5 Hz, H-11)，4.13 (1H, m, H-13)，4.07(1H, s, H-2)，3.99 (1H, d,J=6.0 Hz, H-6)，3.16 (1H, d,J=15.5 Hz, H-19a)，2.94 (1H, d,J=11.5 Hz, H-19b)，2.40(1H, brd,J=2.5 Hz, H-12)，2.37 (1H, t,J=2.5 Hz, H-5)，2.30(1H, m, H-3a)，2.17 (1H, q,J=8.5 Hz, H-14)，2.10 (1H, s,H-9)，2.04 (1H, m, H-15a)，1.95 (1H, d,J=2.0 Hz, H-1)，1.91(1H, m, H-3b)，1.84，1.78 (2H, dd,J=14.5 Hz, H-7)，1.56(1H, dd,J=15 Hz, H-1)，1.16 (3H, s, H-18)；13C-NMR(CDCl3, 125 MHz) δ: 32.8 (C-1)，64.8 (C-2)，38.7 (C-3)，35.4 (C-4)，57.3 (C-5)，64.5 (C-6)，33.6 (C-7)，42.7(C-8)，54.1 (C-9)，49.6 (C-10)，73.6 (C-11)，50.3 (C-12)，70.2 (C-13)，50.9 (C-14)，32.8 (C-15)，146.9 (C-16)，106.9 (C-17)，32.6 (C-18)，59.1 (C-19)，67.6 (C-20)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定该化合物为hetisine。

化合物8：透明沙状结晶 (CH3COCH3)，m.p.292 ～ 293 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOF-MSm/z346.201 8 [M+H]+，分子式为C20H27NO4；1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 5.02 (1H, d,J=8.5 Hz,H-17a)，4.92 (H, d, J=8.5 Hz, H-17b)，4.87 (1H, d,J=3.5 Hz, H-15)，4.79 (1H, s, H-9)，4.61 (1H, m, H-2)，4.51 (1H, m, H-3)，4.13 (1H, q,J=13.0 Hz, 7.5, H-6)，4.06 (1H, s, H-20)，3.97 (1H, m, H-19a)，3.76 (1H,m, H-19b)，0.97 (3H, s, H-18)；13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 29.8 (C-1)，67.6 (C-2)，73.6 (C-3)，41.7(C-4)，54.2 (C-5)，61.4 (C-6)，28.3 (C-7)，43.2 (C-8)，78.8 (C-9)，49.4 (C-10)，38.8 (C-11)，33.4 (C-12)，32.9 (C-13)，41.9 (C-14)，70.1 (C-15)，153.9 (C-16)，106.9 (C-17)，22.2 (C-18)，56.9 (C-19)，70.0 (C-20)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定该化合物为3-epiignavinol。

化合物9：白色针状结晶 (CH3COCH3)，m.p.297 ～ 298 ℃，TLC 喷碘化铋钾试液加热显橘红色。TOF-MSm/z344.258 9 [M+H]+，分子式为C20H27NO3；1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 8.78 (1H, s, H-20)，4.73(1H, s, H-17b)，5.48 (1H, t,J=5.0 Hz, H-17)，5.01 (1H,d,J=5.0 Hz, H-17)，4.99 (1H, s, H-15)，4.96 (1H, s,HO-15)，4.18 (2H, t,J=5.0 Hz, HO-CH2-CH2-N)，3.90,3.87 (2H, m, H-6)，3.74 (1H, m, H-19a)，3.53 (1H, d,J=5.5 Hz, H-19b)，2.31 (1H, brs, H-12)，2.08 (1H, t,J=6.0 Hz, H-5)，1.88 (1H, m, H-3)，1.02 (3H, s, H-18)；13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 40.2 (C-1), 19.8 (C-2)，35.2 (C-3)，32.9 (C-4)，44.1 (C-5)，18.7 (C-6)，30.2 (C-7)，37.0 (C-8)，38.9 (C-9)，45.4 (C-10)，27.1 (C-11)，34.2(C-12)，24.9 (C-13)，24.9 (C-14)，73.8 (C-15)，155.5(C-16)，109.1 (C-17)，24.4 (C-18)，63.3 (C-19)，181.7(C-20)，57.0 (C-21)，58.2 (C-22)。以上数据与文献[11-12]报道基本一致，故鉴定该化合物为guan fu base H。

3 讨论

附子中所含生物碱为C19 和C20 -二萜生物碱，其中以C19 -二萜生物碱为主[13]。C19 -二萜生物碱以乌头碱（Aconitine）、次乌头碱（Hypaeonitine）、中乌头碱（Mesaeonitine）等为主。乌头碱是双酯型二萜生物碱，在C8 和C14 位均联有酯键，具有强烈毒性，其性质不稳定易水解。通过高热处理可使其先水解为毒性较小的单酷型苯甲酰乌头碱（Bneozylacnoine），仅C14 位联有酯键，苯甲酰乌头碱的毒性仅为乌头碱的1/200。苯甲酰乌头碱可进一步分解为无酯键、毒性极低的乌头胺（Acnoine），其C8 和C14 位均无酯键相联。乌头胺的毒性仅为乌头碱的1/2 000[14]。因此，实验采用95%乙醇热回流方法提取附子中二萜生物碱。结果原药材中含量较高的剧毒双酯型生物碱乌头碱没有分离得到、分离鉴定出的是其相应的水解产物低毒的单酯型苯甲酰乌头碱、苯甲酰中乌头碱和苯甲酰次乌头碱。该提取条件为附子中剧毒双酯型生物碱乌头碱的稳定条件及水解调节提供依据。

此外，在对附子进行提取分离的过程中，根据其生物碱pH值的不同，采用不同酸碱条件提取的方法，将生物碱分为脂溶性弱碱性和强碱性生物碱。结果表明，在两个不同部位中，C19-二萜生物碱多从脂溶性弱碱性生物碱部位分离得到，而C20-二萜生物碱多从强碱性部位分离得到。研究结果为附子的药效物质基础研究及其综合质量评价提供科学依据。