35份绿豆种质资源萌发期耐盐碱性综合评价及耐盐碱机制分析

关键词：绿豆；萌发期；盐碱胁迫；综合评价；生理响应；核酸损伤修复

绿豆[Vigna radiata （L.）R．Wilczek]是豆科豇豆属一年生直立草本植物。绿豆籽粒富含淀粉、蛋白质、矿物质和维生素等营养成分，可加工制成多种菜品，故有“食中佳品，济世长谷”之称。随着人们生活水平提高和健康意识增强，绿豆的需求量显著增加。

绿豆原产于中国，在中国已有两千余年的栽培史。绿豆在全国各地均有种植，产区主要集中在黄淮流域及东北和华北地区。目前，我国现有盐渍化及次生盐渍化的耕地达4x107hm2以上，约占我国耕地面积的10%，主要分布在东北、西北、中北部、华北和滨海五大区域。其中，中国东北地区主要为苏打盐碱地，盐碱地面积居世界苏打盐碱化土壤前三位。土壤盐碱化严重影响绿豆生长和产量形成，因此，筛选适宜盐碱地区种植的绿豆种质资源对其品种选育和产量提高意义重大。

与温度、水分等非生物胁迫不同，盐碱胁迫在植物生长初期就已经存在，并一直伴随其整个生育期。因此，在种子萌发期进行耐盐碱性筛选，能够快速准确反映植株的抗逆水平。目前，关于绿豆种质资源耐盐碱性筛选和评价体系建立的研究已有一些报道。于崧等对30个不同基因型绿豆萌发期和苗期的耐盐碱性进行分析和评价表明，萌发期的活力指数、发芽率、根冠比、胚根长、胚芽长可以作为耐盐碱性强弱评价的关键指标：苗期的叶片净光合速率、相对电导率、最大光化学效率、可溶性糖含量、初始荧光及地上干重和地下鲜重可作为耐盐碱性强弱评价的关键指标。胡亮亮等在苗期用150mmol·L-1NaCl溶液模拟盐胁迫对346份国内外绿豆种质进行处理，通过主成分分析、隶属函数分析、耐盐性综合评价分析、聚类分析等方法进行综合评价和耐盐性鉴定，结果表明根鲜重、根干重、根长、根分枝数、根体积和地上部鲜重是绿豆苗期耐盐性评价的主要指标。李小雷等利用6个不同浓度NaCl溶液对19份绿豆资源进行萌发期的耐盐性鉴定，筛选得到高耐盐材料4份和耐盐材料14份。

植物在遭遇逆境胁迫时，过量积累的活性氧（ROS）会引起膜脂过氧化、酶活性丧失、蛋白质降解、呼吸作用异常等现象。当植物体内的ROS产生和代谢发生紊乱时，植物会启动多种抗氧化机制（包括酶促系统和非酶促系统）来应对ROS过量积累所带来的伤害。酶促系统一般包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）等。绿豆在盐胁迫下常表现为提高渗透调节物质含量和抗氧化酶活性。近年来的研究发现，过量积累的ROS能够攻击基因组DNA，破坏核酸的稳定性，最终导致DNA损伤。基因组核酸一旦受到不可逆的损伤，就会引起植物体一系列的变化，包括基因表达调控紊乱、生理生化进程受阻等，甚至引起生长发育异常，最终导致生物量和产量降低。对于植物中DNA损伤修复研究，在由UV-B、重金属等引发的拟南芥基因组损伤中较为深入。近年来在菜豆、大豆、黑小麦、烟草等的研究中发现盐胁迫等非生物胁迫也能够引起基因组损伤。然而，目前关于盐碱胁迫与绿豆DNA损伤的关系、不同耐盐碱性绿豆资源抗氧化能力与基因组稳定性的联系等问题还研究较少。

韩毅强等研究表明，大庆地区的盐碱土壤类型属于硫酸盐型苏打盐碱土，土壤盐碱成分含量比为NaCl：Na2 C03：Na2 S04：NaHC03=1：1：9：9，pH值8.9，Na+总量为80

mmol·L-1。本研究选择上述类似混合盐碱溶液进行绿豆资源筛选，更有利于大庆地区耐盐碱资源的鉴定和品种选育。绿豆属于低耐盐作物，我们的预试验（结果未列出）也表明在80mmol·L-1的上述盐碱溶液中，大部分绿豆资源表现为发芽率及相关发芽指标受到严重抑制，故选用40 mmol·L-1的中等浓度混合盐碱溶液进行绿豆资源筛选较为合适。

本试验对35份绿豆种质材料进行萌发期盐碱胁迫处理，对萌发相关的14个指标进行隶属函数分析、主成分分析、相关分析、回归分析和聚类分析，对不同绿豆种质资源的耐盐碱性进行综合鉴定和评价，对筛选出的耐盐碱绿豆种质进行抗氧化酶活性和基因组DNA的随机扩增多态性DNA标记（RAPD）分析，旨在建立耐盐碱绿豆资源的筛选指标和评价方法，明确盐碱胁迫与绿豆DNA损伤的关系以及不同耐盐碱性绿豆资源抗氧化能力与基因组稳定性的关系，为盐碱地区绿豆品种选育、耐盐碱绿豆优异资源筛选以及绿豆耐盐碱基因鉴定提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试35份绿豆种质材料均由黑龙江八一农垦大学作物种质资源创新实验室提供，保存于国家杂粮工程技术研究中心种质资源库。种质材料名称见表1。

1.2试验设计

试验于2023年6月在国家杂粮工程技术研究中心进行。试验以蒸馏水为对照，以40mmol·L-1盐碱溶液（NaCl：Na- C03：Na2 S04： NaHC03=1：1：9：9， pH值8.9）进行盐碱胁迫（SA）处理。选取大小均一、饱满健康的绿豆籽粒，2.0%次氯酸钠灭菌10min，蒸馏水洗涤2次，处理液（蒸馏水或40mmol.L-1盐碱溶液）再次清洗2次。将冲洗后的种子均匀摆放在铺有双层滤纸的培养皿中，每皿15粒种子，种子表面覆盖1层滤纸，加6mL处理液。培养皿置于恒温人工气候箱中，设置温度（25±1）℃，黑暗培养7d。每天更换滤纸和处理液。每处理重复3次。

1.3测定指标及方法

当绿豆种子胚根长度大于种子长度时视为萌发。第5天时，按照《农作物种子检验规程发芽试验》（GB/T 3543.4-1995），统计绿豆种子发芽势（GE）；第7天时，统计种子发芽率（GR），选择10粒有代表性的种子测定胚根长（RL）、总鲜重（TFW）、子叶鲜重（CFW）和胚根鲜重（RFW）。85℃烘干样品至恒重，测定其总干重（TDW）、子叶干重（CDW）和胚根干重（RDW），并计算活力指数（VI）、子叶相对含水量（CWC）、胚根相对含水量（RWC）和根冠比（R/S）。

相关指标计算公式如下：

（1） GE（%）=第5天发芽种子粒数／供试种子粒数×100；

（2） GR（%）=第7天发芽种子粒数／供试种子粒数×100：

（3）发芽指数（GI）=∑Gt/Dt，其中，Gt为第t天的发芽种子粒数，Dt为相应的发芽天数；

（4）VI=发芽指数×胚根鲜重；

（5）CWC（%）=（CFW-CDW）/CFWx100;

（6）RWC（%）=（RFW-RDW）/RFWx100;

（7）R/S=胚根干重／子叶干重；

（8）综合评价相关指标：

1.4胚根DNA提取与RAPD分析

利用CTAB法进行样品DNA提取，Nanodrop 2000测定DNA质量和浓度。将DNA浓度稀释至100ng·uL-1后，利用黑龙江八一农垦大学作物种质资源创新实验室前期建立的方法进行基因组DNA的RAPD分析。试验设置3次生物学重复和3次技术重复，每次试验中至少出现2次RAPD片段的定义为有效多态性差异。随机扩增多态性引物序列为Random Primer 1：5 7-CT-GCGCTGGA-3'; Random

Primer 2：5'-CT-GGGGCTGA-3'; Random Primer 3：5'-GGTG-GTGATG-3';Random Primer 4：5'-AAAGTGCGGC-3'.

1.5数据处理与分析

利用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（Plt;0.05）、主成分分析、聚类分析和相关性分析并绘制聚类图；用Origin 2021软件绘制相关系数聚类热图；用GraphPad Prism 9软件绘制柱形图。

2结果与分析

2.1盐碱胁迫下35份绿豆种质萌发期相关指标的差异分析

由表2可知，盐碱胁迫处理下，35份绿豆种质的总鲜重、总干重、子叶鲜重、子叶干重、胚根鲜重、胚根干重、发芽势、发芽率、根长、根冠比、胚根相对含水量、子叶相对含水量、发芽指数、活力指数共14项指标存在差异，其中胚根鲜重、活力指数、胚根干重和总鲜重的变异系数较大，分别为1.128、0.716、0.663和0.634，发芽率、胚根相对含水量和子叶相对含水量的较小，分别为0.137、0.169和0.090。

2.2 35份绿豆种质萌发期耐盐碱性指标的主成分分析

如表3所示，对14个指标进行主成分分析共得到5个主成分，对应的特征根分别为4. 169、3.289、2.159、1.041和1.010，贡献率分别为29.782%、23.492%、15.402%、7.438%和7.216%，累计贡献率为83.330%。表明这5个主成分可以充分反映盐碱胁迫下绿豆萌发期14个测量指标的变化趋势。其中，第1主成分的贡献率最高，是盐碱胁迫高度敏感主成分，胚根鲜重的特征向量值最高，为0.899，总鲜重次之，为0.833，故选择胚根鲜重和总鲜重作为绿豆萌发期耐盐碱的主要评价指标。

2.3 35份绿豆种质萌发期耐盐碱性的隶属函数及聚类分析

根据5个主成分计算出35份绿豆种质的隶属函数值和综合评价值（D），见表4，并根据D值对不同绿豆资源萌发期的耐盐碱性进行排序，D值越大表明该绿豆资源萌发期盐碱耐性越好。可以看出，LSS-13的D值最大，为0.703：新育1号次之，为0.676;绿丰2号的D值最小，为0.054。

通过组间联接法基于综合指标对35份绿豆种质资源进行聚类分析，在平方欧氏距离为4处可将其划分为5大类（图1）。其中第1大类包含6个绿豆种质，分别为LSS-13、新育1号、黑绿豆（2020）、洮绿8号、赤绿6号和洮绿9号，综合评价值高，为强耐盐碱种质：第Ⅱ大类包含7个种质，综合评价值较高，为耐盐碱种质；第Ⅲ大类包含9个种质，综合评价值中等，为中耐盐碱种质；第Ⅳ大类包含7个绿豆种质，综合评价值较低，为盐碱敏感种质；第V大类包含6个种质，综合评价值低，为盐碱极敏感种质，分别为潍8×冀黑452020F8、绿珍珠辽宁铁岭、LD13-20、黑农院LD05-08、辽绿5号和绿丰2号。

2.4绿豆种质萌发期指标与D值的相关性分析及耐盐性评价指标筛选

对盐碱胁迫下14个绿豆萌发期指标进行相关性分析（图2）可知，胚根鲜重、子叶鲜重和总鲜重与D值均呈显著正相关，发芽率、胚根长、子叶干重、胚根干重、总干重和根冠比与D值呈正相关，但均未达显著水平。综合主成分分析和相关性分析结果表明，总鲜重、子叶鲜重、胚根鲜重、胚根干重和胚根长可作为绿豆萌发期耐盐碱性评价的一级指标，发芽率、胚根长、子叶干重、胚根干重、总干重和根冠比可作为绿豆萌发期耐盐碱性评价的二级指标。

2.5盐碱胁迫对不同耐盐碱性绿豆种质萌发期抗氧化相关酶活性的影响

综合上述试验结果，选择强耐盐碱种质LSS-13和盐碱极敏感种质LD13-20作为材料，进一步分析其耐盐碱的生理差异。由图3可知，盐碱胁迫处理下两个绿豆种质子叶和胚根中抗氧化酶活性存在显著差异。与对照相比，盐碱胁迫显著提高两个绿豆种质子叶SOD、POD（LD13-20除外）、CAT、APX活性，其中LSS-13子叶APX活性增幅最大，达364.71%（Plt;0.05）；盐碱胁迫处理下不同绿豆种质胚根中4种酶活性（LSS-13的SOD及LD13-20的POD除外）均显著提高，其中LSS-13的POD活性增幅最大，达166.67%（Plt;0.05）。

2.6盐碱胁迫下不同耐盐碱性绿豆种质萌发期胚根基因组RAPD分析

为了明确盐碱胁迫下绿豆基因组DNA损伤情况，利用RAPD对不同绿豆资源基因组的多态性进行分析，结果见图4和表5。与对照相比较，盐碱胁迫处理后两个绿豆资源基因组的RAPD片段数均有明显变化，LSS-13发生变化的条带数为29条，LD13-20发生变化的条带数为35条。与LD13-20相比较，强耐盐碱资源LSS-13在盐碱胁迫处理下表现出更强的基因组稳定性。

3讨论

我国东北地区的盐碱土壤类型为苏打盐碱土。一般认为，由Na+过量积累引起的盐胁迫会对植物产生渗透胁迫和离子毒害，进而严重抑制植株生长和产量形成。然而，与单一Na+积累的盐胁迫（如NaCl）相比较，盐碱胁迫（如Na2C03和NaHCO，）还会对植物生长造成高pH胁迫，植物的耐盐碱机制也与耐盐机制存在差异。Wang等研究表明，相同Na+浓度下，碱性盐（NaHC03、Na2C03）对大豆幼苗的危害程度大于中性盐（NaCl、Na，S04）。

种子萌发期是作物生长的重要起始阶段。与干旱、低温等非生物胁迫不同，盐碱胁迫下种子首先需要克服的就是萌发障碍。因此，在萌发期对绿豆种质资源进行鉴定和评价对选育耐盐碱材料尤为重要。在对萌发期种质资源进行耐盐（碱）筛选和鉴定评价时，前人多采用胁迫指数法、相对盐害率、隶属函数法等进行。胁迫指数法主要通过预先设定的标准，通过比较对照条件和胁迫条件下植株的生长差异进行绝对耐盐碱性评价。隶属函数法通过综合评价群体的各个性状指标，再设定划分标准进行耐盐碱能力差异评估。目前，大豆、玉米、小麦已经广泛采用综合评价方法对作物的耐逆性进行鉴定。本研究以14个萌发相关指标作为绿豆资源耐盐碱性的鉴定指标，通过主成分分析、隶属函数分析、聚类分析和相关性分析对其进行综合评价。主成分分析能够将数据维度降低，把多个指标转为少数综合指标来表征大部分目标性状，每个主成分均是原始指标的线性组合。主成分分析结果表明，绿豆萌发期14个萌发相关指标可简化为5个主成分，这5个主成分可代表萌发性状83.330%的信息：通过隶属函数和聚类分析将35份绿豆资源划分为5类，I类为强耐盐碱种质（6个），Ⅱ类为耐盐碱种质（7个），Ⅲ类为中耐盐碱种质（9个），Ⅳ类为盐碱敏感种质（7个），V类为盐碱极敏感种质（6个）。通过主成分分析和相关性分析综合得出，总鲜重、子叶鲜重、胚根鲜重、胚根干重和胚根长可作为绿豆萌发期耐盐碱性评价的主要指标。

在非生物胁迫下，激活SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性可有效降低ROS积累引起的氧化损伤。一般认为，植物体内抗氧化酶活性高低能够直接反映其活性氧清除能力。本试验结果表明，盐碱胁迫显著提高绿豆子叶和胚根中的抗氧化酶活性，这表明抗氧化系统参与了绿豆的盐碱胁迫响应：比较两个不同耐盐碱性品种的酶活性表明，强耐盐碱绿豆种质LSS-13较盐碱极敏感种质LD13-20具有更强的ROS清除能力。这可能是两类种质出现盐碱耐性差异的主要原因，这与Zhao等在大豆中的研究结果一致。本研究对子叶和胚根中抗氧化系统的研究发现，子叶中APX活性差异幅度最大，而在胚根中POD活性差异幅度最大。APX和POD都具有清除过氧化氢的作用，但其反应过程存在差异。POD能够将过氧化氢转化为氧和水，同时氧化还原底物，而APX是将抗坏血酸还原为脱氢抗坏血酸，并将过氧化氢转化为水，从而减少氧化损伤。这表明绿豆子叶和胚根在响应盐碱胁迫时通过启动不同的抗氧化调控系统来降低氧化损伤。

内源或外源因素造成的基因组DNA损伤及其修复失败能够直接影响遗传信息的稳定传递，进而对植物的生长发育造成严重影响。在分子毒理学中，RAPD分析是一种比较常用的基于PCR技术的DNA指纹技术，用来检测核酸损伤程度。利用此方法能够准确、快速、高通量地检测基因组DNA的变化情况，核酸片段数量变化越多，表示基因组损伤程度越严重。逆境胁迫产生的过量ROS能够直接造成基因组DNA的损伤。本研究发现，盐碱胁迫处理后绿豆基因组RAPD片段增加，表明盐碱胁迫能够造成绿豆DNA受损。这与我们课题组在大豆和芸豆中的研究结果一致。与盐碱极敏感种质LD13-20相比较，盐碱胁迫处理后LSS-13基因组的RAPD片段变化程度更小，表明LSS-13的基因组DNA损伤程度较低，具有更强的活性氧清除能力，这可能是强耐盐碱种质LSS-13基因组稳定性更强的重要原因。

4结论

本试验结果表明，总鲜重、子叶鲜重、胚根鲜重、胚根干重和胚根长可作为绿豆萌发期耐盐碱能力鉴定评价的主要指标。对35份绿豆种质进行萌发期耐盐碱性鉴定及综合评价，筛选出LSS-13、新育1号、黑绿豆（2020）、洮绿8号、赤绿6号和洮绿9号6个强耐盐碱种质，潍8×冀黑45 2020F8．绿珍珠辽宁铁岭、LD13-20、黑农院LD05-08、辽绿5号和绿丰2号为盐碱极敏感种质。盐碱胁迫激活了绿豆萌发期子叶和胚根中的抗氧化酶系统，可有效提升绿豆种质的耐盐碱水平。盐碱胁迫能够引起绿豆基因组DNA损伤，耐盐碱绿豆种质（LSS-13等）可能通过维持较高的活性氧清除能力减少其DNA损伤。本研究结果可为绿豆耐盐碱种质资源的利用及盐碱地区绿豆育种和种质创新提供理论依据。