小麦四个抗白粉病基因的KASP标记检测

关键词：小麦：抗白粉病基因：Pm13：KASP标记：分子标记辅助选择

小麦白粉病是影响小麦生产的重要病害之一，在国家提倡农药减量化使用的背景下，利用抗白粉病基因选育抗病品种能有效降低白粉病危害，减少农药用量，促进农业绿色转型。

Pm21是我国小麦育种中利用最成功的抗白粉病基因之一，从南京农业大学陈佩度等创制出普通小麦一簇毛麦T6VS.6AL易位系至今已有近30年，该基因在我国大部分麦区仍保持全生育期广谱抗性。T6VS.6AL异位系在创制之初就被发放到全国大部分小麦育种单位，广泛用于品种选育，至今含有Pm21的审定品种超过30个，累计推广面积超过400万hm2。Pm21被克隆后表明该基因编码典型的CC-NBS-LRR抗病蛋白，虽然具有广谱抗性特征，但仍属于小种专化抗性基因，已发现对Pm21具有毒性的白粉病菌株。

同样利用簇毛麦创制的T6VS. 6DL易位系Pm97033等，携带广谱抗白粉病基因PmV。通过差异表达基因分析和基因组编辑技术证实Pm9 7033中的抗白粉病基因是Pm21#4，与Pm21同源，可能就是PmV。将含有T6VS.6AL（Pm21）的扬麦18和含有T6VS.6DL（PmV）的扬麦22杂交构建重组自交系，对F分组分析发现T6VS.6AL有利于增加顶部小穗育性，但穗粒数减少，而T6VS.6DL导致株高增加，利用这两个基因进行抗白粉病改良时需注意对穗粒数和株高的选择。

Pm12来源于拟山羊草，位于易位染色体T6BS-6SS.6SL的6S染色体短臂，具有突出的白粉病抗性。通过回交获得了仅含有部分6SS染色体的渐渗系1338-8（T6BS-6SS.6BL），但是仍表现晚熟、产量低等不利农艺性状，因此在育种中应用较少。近期Pm12被克隆，证明是Pm21的直系同源基因。

Pm13来源于高大山羊草3SIS，通过染色体工程被易位至普通小麦的3B或3D染色体，对我国小麦白粉病具有较好抗性。该外源片段和小麦中对应的染色体为部分同源关系，不发生交换，因此基因定位和克隆研究进展缓慢。通过开展Pm13的转育和基因聚合工作创制了不少种质材料，但Pm13仅存在于少数审定品种中，可能和携带的外源片段较大有关。

根据Pm21、PmV和Pm12的基因序列开发的KASP标记可以有效区分这3个基因，为开展小麦分子标记辅助回交转育工作奠定了基础。Cenci等开发了Pm13的SCAR标记Xutv14，该标记和Pm13的距离可能较远，两者表现为完全连锁，可为其回交转育提供精准标记。但SCAR标记检测需要凝胶电泳等较为复杂的实验过程，检测效率相对较低。为提高Pm13的检测效率，了解上述4个抗白粉病基因在山东小麦中的利用情况，本研究通过对Xutv14的PCR产物进行测序和引物设计将其转化成KASP标记，并对2022-2023年山东省小麦区试材料进行KASP标记检测，为利用KASP标记开展Pm21、PmV、Pm12和Pm13的回交转育提供参考，以期促进山东省小麦抗白粉病的分子标记辅助选择育种。

1材料与方法

1.1材料

2022-2023年山东省区试小麦品系取样于山东省农业科学院作物研究所济南试验基地，共142份，其中高产区试组108份（编号GQ1-GQ107和GQCK）、强筋区试组34份（编号QQ1-QQ33和QQCK）。阳性对照扬麦18（含Pm21）、扬麦22（含PmV）、1338-8（含Pm12）、3778（含Pm13）和Pm13F1（含Pm13）由江苏大学何华纲老师提供。

1.2KASP标记转化

以小麦品系3778的DNA为模板，用SCAR标记Xutv14进行PCR扩增，PCR原液直接送北京擎科生物科技有限公司青岛分公司进行一代测序，用DNAMAN8进行序列比对，在小麦多组学网站WheatOmics用BLAST工具与中国春参考基因组V2.1比对。根据比对结果设计显性KASP标记Pm13K，引物为Pm13 H：5'-GCCA-CAAGAAGGTGATTAATCACCAGA-3'和Pm13C：5'-GGGTCAACTTGGAGCTCCTCC-3'。

1.3DNA提取和KASP标记检测

返青期每品系取3个单株叶片小段2cm，采用简化高盐低pH法混合提取DNA，KASP-Pm21、KASP-Pm12、KASP-PmV和Pm13K引物通过北京擎科生物科技有限公司青岛分公司合成。参考Rasheed等报道的方法进行KASP检测，DNA被放人96孔板中，分成两板，第一板包括CQl-CQ93和2份对应基因的阳性对照，第二板包括CQ94-CQ107、QQ1-QQ33、GQCK和QQCK。

2结果与分析

2.1Pm13K的转化和检测

用Xutv14扩增3778的DNA，设置1个重复。PCR原液直接测序，用DNAMAN 8比对重复测序样品间的序列差异，剔除两侧不一致序列后获得508 bp序列。将其与中国春参考基因组V2.1进行BLAST比对，未发现高相似度序列（图1）。直接设计引物开发标记Pm13K，用已知含有Pm13的3778和Pm13Fi为阳性对照，以扬麦18、扬麦22、1338-8为阴性对照进行测试，结果（图2）表明，3778和Pm13F，样品全部为Hex基因型，其他样品无信号，黑点为无模板对照。表明转化的KASP标记Pm13K可以用于Pm13的检测。

用Pm13K对140份区试材料和2份3778（阳性对照）进行检测，结果见图3。其中图3a是第一板的检测结果，图3b是第二板的检测结果（考虑到Pm13K为显性标记，第二板增加了两份阳性对照）。除阳性对照3778为Hex基因型外，全部区试材料均为无信号类型，即不含Pm13。

2.2KASP-Pm2I的检测

利用Pm21的特异性KASP标记对140份区试材料和2份扬麦18（阳性对照）进行PCR扩增和信号检测，结果（图4）显示，除GQ20无信号外，其余的139份区试材料均不含Pm21，表现为Hex基因型，而阳性对照扬麦18为Fam基因型。

2.3KASP-Pm12的检测

利用Pm12的特异性KASP标记对140份区试材料和2份1338-8（阳性对照）进行PCR扩增和信号检测，结果（图5）显示，除1338-8为阳性的Fam基因型外，全部区试材料均为阴性的Hex基因型，即不含Pm12。

2.4KASP-PmV的检测

利用PmV的特异性KASP标记对140份区试材料和2份扬麦22（阳性对照）进行PCR扩增和信号检测，结果（图6）显示，除扬麦22为Fam基因型外，全部区试材料均为Hex基因型，即不含PmV。

3讨论与结论

Pm12的载体材料1338-8创制于2007年，因农艺性状较差可能较少被用于育种。PmV的主要载体品种是扬麦22，2012年通过国家审定，属于春性、红粒、粉质弱筋小麦，与山东省的小麦育种目标差异较大，因此在山东被用作育种亲本也较少。Pm13在二十世纪末作为二线抗源被用于回交转育，后在烟中1934、莱农8621、鲁农89（4） 116和中大01等种质材料中被检测到，但检出率较低，未能广泛应用。Pm21被导人扬麦5号后广泛用于育种，其突出的白粉病抗性使携带该基因的审定品种已超过30个，主要集中在长江中下游和西南麦区，包括扬麦15、扬麦18、扬麦21、内麦8号、内麦9号、南农9918、绵麦37等；在黄淮麦区品种中也发现但数量较少，如石麦14、金禾9123、国麦301、石郑816等。上述4个基因均表现出较强的白粉病抗性，遗憾的是本研究中并未检测到，表明它们在山东小麦育种中的应用较少。虽然在区试品系中未检测到上述4个抗白粉病基因，但个人交流发现Pm21逐渐被部分育种家重视并用于品种选育，含有Pm21的品系正在选育中，还未能进入区试。

小麦近缘物种是小麦遗传改良的重要基因库，黑麦1RS染色体和簇毛麦Pm21在小麦育种中的成功开发为外源基因的利用提供了重要参考。外源抗病基因一般表现突出的抗性，被导入普通小麦时难免带有连锁累赘，影响了其在育种中的应用，需要遗传学家和育种家一起攻坚克难。一方面可通过Ph1b、射线等诱导部分同源染色体的重组获得渐渗系以减少连锁累赘。近日Pm21的次级易位系被创制成功，易位片段大幅减小至36.9～39.1Mb，这为进一步利用大大减轻了负担：另一方面可以通过创制中间材料不断改善基因供体的农艺性状。本研究根据SCAR标记Xutv14的扩增序列成功将其转化为KASP标记Pm13K，与已开发的3个KASP标记一起，可用于Pm13、Pm21、PmV和Pm12的分子标记辅助选择，精准高效地开展回交转育和基因聚合，促进这4个基因在山东小麦抗白粉病育种中的利用。