SDS-PAGE法分析蜂蜜中蛋白质组分的条件优化

王琴

摘 要：本文从分离胶浓度、凝胶厚度和点样量方面对SDS-PAGE电泳法进行优化，探究最适合蜂蜜蛋白质分析的SDS-PAGE电泳条件，证明SDS-PAGE电泳法分析蛋白组学的可靠性，为蜂蜜新鲜度和真实性的鉴别提供参考依据。

关键词：蜂蜜;蛋白质;凝胶电泳

中图分类号：O658.9;S896.1 文献标识码：A 文章编号：1003-5168（2020）14-0129-03

Study on the Condition Optimization of SDS-PAGE Analysis of Protein Components in Honey

WANG Qin

（College of Pharmaceutical Engineering， Chongqing Chemical Industry Vocational College， Chongqing 401228）

Abstract： This paper optimized the SDS-PAGE electrophoresis method in terms of separation gel concentration， gel thickness and spot size， explored the SDS-PAGE electrophoresis conditions that were most suitable for honey protein analysis， and proved that the SDS-PAGE electrophoresis analysis was reliable Sex， provided a reference for the identification of honey freshness and authenticity.

Keywords： honey;protein;gel electrophoresis

蜂蜜是蜜蜂采集花蜜或者蜜露在蜂巢中经过充分酿造而成的天然甜物质，除富含糖类物质，还含有少量的蛋白质、氨基酸、维生素和酚酸类等活性成分[1]，因而具有药食两用的功效[2]，深受人们的喜爱。

我国是蜂蜜的生产和消费大国，市场上的蜂蜜主要是由中华蜜蜂和意大利蜜蜂酿制的，蜂蜜品质参差不齐，造假掺杂的现象较为普遍。蜂蜜中的蛋白质组分主要来自蜂种，少部分来源于蜜源植物。蜂蜜中的蛋白质会随着储藏时间逐渐降解[3]，也受到商业加工的破坏，蜂蜜的蛋白组分完整性可以判定蜂蜜的新鲜程度和真实性，进而反映蜂蜜质量的优劣。SDS-PAGE电泳法可以快速地得出蜂蜜的蛋白组分，可用于蜂蜜质量优劣的判断。本研究主要探究最适合蜂蜜蛋白质分析的SDS-PAGE电泳条件，验证SDS-PAGE电泳法分析蜂蜜蛋白质的可靠性。

1 试验材料与试剂

1.1 样品

油菜蜜，来源于重庆农家中华蜜蜂蜂蜜，未经加工处理。

1.2 试剂与仪器

主要试剂有氢氧化钠（NaOH）、三氯乙酸（TCA）、丙酮、β-巯基乙醇、过硫酸铵、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS、5×SDS的上样缓冲液、考马斯亮藍染色液、脱色液。主要仪器有蛋白质电泳仪、彩色图像扫描仪、电子恒温水浴锅。

2 试验方法

2.1 蜂蜜蛋白质的提取

SDS-PAGE法可以分析蜂蜜中蛋白质的组分，文献研究显示，TCA-丙酮法提取蛋白质的含量最高，蛋白条带种类最多，最适合后续SDS-PAGE[4]对蛋白质的分析。本研究在周莉质等人[5]的方法上进行优化，将油菜蜜4.0 g放入50 mL的离心管中，并放入4 mL无菌水溶解样品，3 000 r/min离心3 min，上清液加入10 mL的TCA-丙酮溶液（1∶9）混合均匀，离心获取蛋白质沉淀，再加入1 mL的丙酮-水溶液（1∶1）清洗沉淀，重复清洗3次，纯化蛋白沉淀用无菌水定容到1 mL，放置于-20 ℃保存备用。

2.2 SDS-PAGE电泳条件的优化

取的油菜蜜总蛋白原液，加0.25倍的5×SDS的上样缓冲液混匀，在沸水浴中煮沸5 min，组装好电泳装置，加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液准备电泳试验。电泳其他条件为：5%浓缩胶。点样后电泳：先80 V恒压20 min，再120 V恒压，当溴酚蓝移动到离底部约0.5 cm时，停止电泳，凝胶染色、脱色。

2.2.1 分离胶浓度试验。按照凝胶组分配方（见表1）制备8%、12%、15%分离胶，以10 μL点样量进行蛋白质电泳。表1中，各种试剂的单位均为mL。

2.2.2 分离胶厚度试验。按照制胶板，采用12%的分离胶，制备厚度为0.75 cm和1.0 cm的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，以10 μL点样量进行蛋白质电泳。

2.2.3 点样量试验。采用12%分离胶，1.0 cm厚度凝胶，分别在5、10、20 μL点样量的条件下进行蛋白质电泳。

3 试验结果

3.1 不同浓度分离胶的SDS-PAGE图谱效果比较

不同浓度的分离胶的蜂蜜蛋白质电泳图如图1所示，8%的分离胶电泳中标准蛋白分离效果好，但是蜂蜜的蛋白质条带不够清晰;15%分离胶的蛋白标准比较集中，不能准确估算蜂蜜的蛋白质分子量;12%的分离胶分离效果是最好的，蜂蜜蛋白条带清晰，易于估算蛋白质分子量。

3.2 不同厚度凝胶的SDS-PAGE图谱效果比较

不同厚度凝胶的蜂蜜蛋白质电泳图如图2所示，结果表明，凝胶厚度为1.0的蜂蜜蛋白电泳效果最好，主要是由于蜂蜜中的蛋白质分子量在100 kDa以下，蛋白质组分的分子量比较相近，凝胶越薄，蜂蜜蛋白质迁移越靠近，SDS-PAGE图上分不开蛋白组分。

3.3 不同點样量的SDS-PAGE图谱效果比较

不同点样量的蜂蜜蛋白质电泳图如图3所示，结果表明，点样量为10 μL的蜂蜜蛋白电泳效果最好。5 μL点样量的蜂蜜蛋白质条带偏少，偏低的蛋白组分不可见;20 μL点样量的电泳图分不开55 kDa处的蛋白组分，表明点样的蛋白质含量过多，蜂蜜中总蛋白的含量为0.1%～0.5%[6]，通过TCA-丙酮提取后的蛋白质浓度不高，按照本试验提取方法，电泳中10 μL点样量适中。

4 结论

本研究通过比较分离胶的浓度、凝胶厚度发现，蜂蜜蛋白质的最优SDS-PAGE电泳条件是：采用厚度为1.0 cm、浓度为12%的分离胶电泳效果最好。不同方法提取的蜂蜜蛋白质浓度不一样，建议进行点样量试验确定最适点样浓度，排除蛋白质含量过低，电泳图检测不出蛋白组分。本研究表明，SDS-PAGE电泳法分析蜂蜜蛋白质组分，具有可靠性，可从蛋白质角度推断蜂蜜的品质。

参考文献：

[1]孙长波，张晶.蜂蜜化学成分研究概况[J].农业与技术，2014（8）：243-248.

[2]马天琛，王倩，程妮，等.热加工对蜂蜜质量影响的研究进展[J].食品与发酵工业，2019（14）：245-249.

[3]刘红云，童富淡，李宜梅等.贮存温度、时间对蜂王浆水溶性蛋白的影响[J].食品与发酵工业，2003（6）：1-4.

[4]Carpentier S C，Witters E，Laukens K，et al.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues：an evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis[J].Proteomics，2005（10）：2497-2507.

[5]周莉质，宗凯，吕侠影，等.蜂蜜蛋白提取以及双向电泳技术分析蜂蜜蛋白条件优化[J].安徽农业科学，2016（3）：85-87.

[6]Brudzynski K，Sjaarda C.Honey glycoproteins containing antimicrobial peptides，Jelleins of the Major Royal Jelly Protein 1，are responsible for the cell wall lytic and bactericidal activities of honey[J].Plos One，2015（4）：120238.