两种叶色血叶兰的转录组分析

摘要：【目的】为丰富血叶兰转录组数据信息，以期帮助兰科植物的功能基因挖掘。【方法】本试验通过Illumina测序平台对两种叶色血叶兰的叶片进行转录组测序和生物信息学分析。【结果】两种叶色血叶兰样品各三个重复总计产出37.23 Gb Clean reads，共获得97 089条Unigene序列，平均长度 1 038.76 bp，N50达到1 892 bp。将得到的 Unigene和8个公共数据库进行比较，31 095个 Unigene获得注释。其中29 730条Unigene在NR数据库中获得注释，与铁皮石斛的同源序列最多。与 GO数据库进行比对，23 871条Unigene在细胞组分、生物进程和分子功能三大类别中获得注释。通过与 KOG数据库的比对，14 791个 Unigene获得注释，这些基因的功能主要集中在三大功能类别：普通功能预测、蛋白的翻译后修饰以及信号转导。在两个品系间的差异表达基因共5 791个。与暗紫色叶片相比，绿色叶片中3 120个基因的表达量升高，2 671个基因表达量降低。差异表达基因的KEGG富集结果表明，最显著性富集的是植物与病原菌相互作用，其次是植物MAPK信号途径和植物激素信号转导途径、光合作用-天线蛋白、还有苯丙烷类代谢途径、类黄酮代谢途径、卟啉和叶绿素代谢途径。【结论】研究结果将为深入发掘血叶兰药用植物的功能基因研究奠定一定的基础。

关键词：血叶兰；转录组；基因注释；叶色

中图分类号：S682.31" " " " " " " " " " "文献标识码：A" " " " " " " " " " " "文章编号：2095-5774（2024）04-0285-11

Transcriptome Analysis of Ludisia discolor with two Leaf Colors

Wu Yingxiang1，Yang Junjie2，ChenYunyun3，Cai Kunxiu2，Chen Xiande3，Zhang Tianxiang2，

Wu Sihao2，Fu Wenqun3*，Zheng Tao2*

（1 Qiangyuan Agricultural Science and Technology Extension Service Center，Qingyuan，Guangdong 511518，China；

2 Fujian Institute of Tropical Crops，Fujian Zhangzhou，363001，China；

3 Minnan Normal University，School of Biological Science and Biotechnology，Zhangzhou，Fujian 363000，China）

Abstract：【Objective】To enrich transcriptome data of Ludisia discolor in order to assist in its functional gene mining.【Method】Leaves of two kinds of L.discolor cultivars with different leaf colors were sequenced by Illumina Hiseq 2 000 and further analyzed by bioinformatics.【Result】37.23 Gb clean reads were generated from three replicates of L. discolor with two leaf colors，which was the de novo assembled into 97 089 unigenes with a mean length of 1 038.76bp，N50 of 1 892 bp. 31 095 unigenes were annotated against 8 prominent bioinformatics databases. Within the NR database，a total of 29 730 unigenes were primarily annotated from L. discolor；with the most homologous sequences to Dendrobium officinale. 23 871 unigenes were annotated in GO database and were divided into three categories：cellular component，biological process and molecular function. There were 14 791 unigenes annotated in KOG function categories，which mainly focused on general function prediction，posttranslational modification and signal transduction. A total of 5 791 DEGs were screened out from‘XGH’vs‘BX’. Compared with the dark-purple leaves，the expression of 3 120 genes increased while the expression of 2 671 genes decreased in green leaves. KEGG enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were most significantly enriched in plant-pathogen interaction；the secondary enriched was MAPK signaling pathway and plant hormone signal transduction，photosynthesis-antenna protein，and the other pathway including phenylpropanoid biosynthesis，flavonoid biosynthesis，porphyrin and chlorophyll metabolism. 【Conclusion】This investigation furnished scientific support for study of functional genes in L. discolor as medicinal plant.

Key words：Ludisia discolor L.；Transcriptome；Gene annotation；Leaf color

血叶兰（Ludisia discolor（Ker-Gawl.）A. Rich.）

为兰科（Orchidaceae）血叶兰属（Ludisia discolor）的多年生常绿草本植物，又名石蚕或石上藕或公石松，具有观赏价值和药用价值，是闽南民间珍稀中草药。在中国的海南、福建和越南、马来西亚等国家地区都有种植［1-2］。血叶兰‘西贡红’是目前市场主要流通的品种，属于原生种，叶片颜色为暗紫色。前期人工选育过程中获得了一株稳定遗传的绿叶突变体单株，经组培扩繁后形成株系，命名为‘碧玺’，该株系叶片从一开始就表现浅绿，且整个生长期都保持这一特性，绿叶是其重要的观赏特征。目前关于血叶兰的研究主要集中在药效［3-5］、药用成分［6-8］、观赏价值分析［9］、组织培养［10-13］、形态结构和遗传多样性［14］、黄酮类合成功能基因［15］等方面，鲜有人对血叶兰的叶色进行研究，制约了血叶兰不同叶色观赏品种的选育。

转录组RNA-Seq测序技术能够分析植物整体基因的转录特征，是研究彩叶植物呈色机制的一种有效手段，此技术可以分析植物不同叶色的差异表达基因进而挖掘关键候选基因［16］。陈燕等［17］通过RNA-seq测序技术，筛选出10个与类黄酮相关的基因，为研究杜梨叶色分子机制提供理论依据。武悦等［18］通过RNA-seq测序技术对瞿麦幼苗叶片的转录本进行测序，可见RNA-seq测序已广泛应用于植物叶片呈色机制的分子机制研究中。由于目前关于血叶兰叶片颜色变化的研究尚未见报道，有必要从分子层面探究血叶兰叶片的呈色机制，为其不同叶色品种选育奠定基础。鉴于此，本研究以暗紫色品系‘西贡红’和绿叶突变体‘碧玺’的叶片为材料，采用RNA-Seq测序技术构建转录组数据库，将得到的Unigene与8个公共数据库比对后进行生物信息学分析，分析、确定叶色变化过程中的差异表达基因，以期为血叶兰呈色机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2023年3月上旬于福建省热带作物科学研究所血叶兰种质资源圃中，采集移栽6个月左右健康的血叶兰暗紫色‘西贡红’和绿叶突变体‘碧玺’的叶片，每种重复3次，用锡箔纸包住叶片，快速放于液氮中保存，用于总RNA提取。

1.2 试验方法

1.2.1总RNA提取及质量检测

按照 Trizol RNA 试剂盒（Promega，USA）分别提取‘西贡红’（XGH）和‘碧玺’（BX）叶片组织的总RNA，并利用超微量分光光度计检测样品中RNA的质量、含量和完整性。

1.2.2 cDNA文库构建

以符合条件的 mRNA为模板，采用6-碱基随机引物，AMPure XP bead核酸纯化试剂盒，PCR扩增等方法，制备 cDNA库。

1.2.3 文库质控及测序

利用q-PCR技术，精确测定 cDNA文库中的有效浓度（文库有效浓度gt;2 nmol/L）。库检查通过后，委托北京百迈客生物科技有限公司利用 Illumina技术对其进行RNA-seq高通量测序。

1.2.4 De novo拼接和注释

通过筛选和测序，可以获取Raw reads，获得Clean reads，De novo拼接是在 Trinity软件［35］中执行的。利用 NCBI数据库中的 BLAST将拼接完成的Unigene与NCBI无冗余蛋白质序列数据库NR（NCBI Non-redundant Database）、Swiss-Prot数据库、 KOG（euKaryotic Orthologous Groups）数据库和 KEGG（Kyotoencyclopedia of Genes and Genomes）数据库、COG （Clusters of Orthologous Groups of proteins）（E≤1e-5）数据库、TrEMBL数据库进行比对和注释。利用 HMMER3.0package与Protein family（Pfam）进行比对（hmmscane-value≤1e-2）。利用Blast2go（http：//www.blast2go.com/b2ghome）软件和WEGO软件进行GO（Gene Ontology）注释和分类统计。

1.2.5差异基因表达分析

利用高通量测序技术对‘西贡红’和‘碧玺’6个样品叶片的转录组数据进行比较分析。使用DESeq R软件包（1.10.1）对血叶兰‘西贡红’和‘碧玺’叶片进行组间的差异表达分析，用FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值表示基因的表达量，以两组间差异倍数（fold change，FC）的对数值的绝对值即| log2FC |≥1，且FDR（1 discovery rate，FDR）lt;0.05作为筛选标准，满足此筛选标准的基因即为差异表达基因（differential gene expression，DEGs）。将筛选到的DEGs分别在KEGG数据库进行比对，对DEGs进行KEGG代谢通路富集分析。

2 结果与分析

2.1 血叶兰转录组测序

为了提高物种低表达水平转录本的测序准确性，对血叶兰的6份样品进行转录组测序，获得平均 37.23 Gb Clean reads，各样品Clean Data均达到5.81 Gb，Q20、Q30的碱基百分比分别在97%、93%以上，GC碱基含量介于45.95%～46.91%（表1），研究结果显示，基于高通量测序技术的血叶兰转录组测序数据具有很高的质量，Clean reads质量合格，可以继续进行后续的基因拼接。

2.2 数据拼接、组装与注释

由于血叶兰没有可供参考的基因组数据，通过Trinity软件对获取的测序数据进行Denovo组装，总共获得了254 585条转录本，这些转录本的总序列长度达343 971 647 bp，平均每条转录本的长度为1 351.11 bp。其中，N50值为2 145 bp。进一步地，从这些转录本中提取了97 089个Unigene片段，它们的总长度为100 851 717 bp，平均每个Unigene的长度为1 038.76 bp。Unigene的N50值为1 892 bp，这表明超过50%的Unigene长度超过了这一标准，说明数据组装效果较好（表2）。

通过BLAST将Unigene与8个公共数据库进行比对，共31 095 Unigene获得注释，占全部 Unigene的30.03%，不同数据库注释数量差别较大（表3）。获得TrEMBL数据库注释的Unigene有29 786条，所占比例（30.68%）最大，其它注释所占比例从大到小分别是 NR数据库（30.62%）、 GO数据库（24.59%）、 KEGG数据库（18.19%）、Pfam数据库（16.07%）、Pfam Swiss-Prot数据库（15.57%）、KOG数据库（15.23%）。获得COG数据库注释的Unigene最少，只有5 274条。Unigene注释结果显示，长度为300～1 000 bp的有9 903条，占10.20%；长度大于1 000 bp 的Unigene18 012条，占18.55%（表3）。

2.3 血叶兰Unigene的NR分类

将血叶兰的Unigene与NR数据库进行比对，29 730条获得注释，与铁皮石斛（Dendrobium catenatum）的同源序列最多，注释比占38.06%；其次为小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）注释比为12.75%；深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）注释比为5.82%；其他有一定匹配度的物种分别是葡萄（Vitis vinifera），占比 0.53%；玉米（Zea mays），占比2.19%；土瓶草（Cephalotus follicularis），占比1.23%；油棕（Elaeis guineensis），占比0.95%；凤梨（Ananas comosus），占比0.94%；扁桃（Prunus dulcis），占比0.86%；红车轴草（Trifolium pratense），占比0.85%；其他物种占比34.12%（图 1）。

2.4血叶兰Unigene 的GO分类

根据NR数据库中的注释结果，再利用WEGO，对所有比对的 23 871条Unigene按功能分类，将其划分为3大类41种功能组，即：细胞组分（18 890条）、分子功能（27 660条）和生物进程（36 905条）。细胞组分类别中包含4种功能组， 其中定位于细胞质基因比例为34.39% （6 496条）、定位于细胞器和细胞膜基因占比56.95% （10 757条）。在分子功能的15种功能组中，最多的是具有结合功能的14 370种（占比51.95%），具有催化作用的有10 716种（占比38.74%）。在生物进程类别的22种功能性组中，12 972条（占比35.15%）属于代谢过程，13 386条（占比36.27%）属于细胞进程（图 2）。

2.5 血叶兰Unigene的KOG分类

通过与KOG数据库的比对，发现了14，791条 Unigene，共注释25种功能分类，高丰富度的基因类别为普通功能预测，占40.59%（6 004条）。其次是翻译后修饰、蛋白转运类群及信号传导机制类群，分别占 8.35%（1 235条）和 6.84%

（1 012条）。而 Unigene中仅有极少数的细胞活性被注释（图 3）。

2.6 差异表达基因的鉴定

为了寻找血叶兰叶片呈色相关的候选基因，对测序后得到的基因进行差异表达分析。结果表明，红色叶片‘西贡红’和绿色叶片‘碧玺’品系间共有5，791个差异表达基因（Padjlt; 0.05，| log2Fold Change | gt;1）。其中，与红色叶片‘西贡红’相比，绿色叶片‘碧玺’中表达量增加的基因有3 120个，而表达量降低的基因有

2 671个 （图4a，4b）。

2.7差异表达基因的KEGG富集分析

将血叶兰unigene 与KEGG 数据库进行比对，共有18 341条 unigene 参与了136个代谢通路，占总unigene的18.89%，分为五大代谢通路类型，分别是细胞进程、新陈代谢、生物系统、基因信息进程、环境信息进程，参与新陈代谢途径unigene的数量最多，其次为基因信息进程代谢途径。本研究集中叶色形成相关因素富集分析，其中，共有64条unigene参与黄酮类化合物生物合成代谢通路，有58条unigene 参与胡萝卜素生物合成代谢通路，有14条unigene参与黄酮和黄酮醇生物合成代谢通路，有213条unigene参与苯丙烷生物合成代谢通路，有110条unigene参与光合作用通路，有43条unigene参与光合作用-天线蛋白通路，有64条unigene参与卟啉和叶绿素代谢通路。

差异表达基因的 KEGG 富集分析能够揭示相关代谢途径的变化。红色叶片‘西贡红’和绿色叶片‘碧玺’差异表达的基因中共有123条被注释到KEGG中，本研究中只列举富集显著性最可靠的前20个通路（图5）。最显著性富集的是植物与病原菌相互作用（plant-pathogen interaction），其次是植物MAPK信号途径（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和植物激素信号转导途径（plant hormone signal transduction），光合作用-天线蛋白，还有苯丙烷类代谢途径、类黄酮代谢途径、卟啉和叶绿素代谢途径等。

3 讨论

我们利用 llumina高通量测序方法，共检测到了血叶兰97 089个 Unigene，平均长度1 038.76 bp；

并通过对 Unigene全长、GC碱基含量、Q20及Q30分析，测序结果相对较好。Unigene的注释资料有助于研究血叶兰属的基因功能。虽然还有部分血叶兰Unigene没有被完全解析，但是其功能基因鉴定和分子标记位点信息，也为进一步研究其基因资源和类群的遗传多样性奠定了基础。经 NR数据库比对，29 730条Unigenes获得注释，与铁皮石斛匹配度较高，究其原因可能是二者同属兰科兰亚科。与陈育青等［15］的测序结果有所差异，已报道的研究结果公石松（血叶兰的别名）与油棕的同源性较高，本研究中的测序结果与油棕只有0.95%的同源性，造成这一差异的原因，可能是品种不同。兰科物种基因组信息匮乏，公共基因组数据库中缺乏完整的信息，且未发现新的独特的功能信息，这是导致该物种与其它物种基因组不完全吻合的重要因素。

叶色呈色是一个十分复杂的生物学过程，它不仅受环境因子的影响，而且还与植物自身的色素合成代谢有关。近年来，高通量转录组测序技术的发展，为了解植物叶片呈色机理的研究提供了帮助［19］。但大多数兰花物种的遗传信息尚不清楚。转录组学是指一个器官某一具体生长阶段中全部转录本的总和，它可以从某种意义上弥补基因组信息缺失的缺陷，从而可以从整体水平上解析基因之间的分子调控网络及调节机制［20-21］，绿色突变体‘碧玺’是研究叶色形成机制的良好材料。本研究中，通过转录组分析鉴定出5，791个在暗紫色品系‘西贡红’和绿色突变体‘碧玺’叶片中差异表达的基因，通过对这些差异表达基因的筛选，发现差异表达基因被显著富集到植物与病原菌相互作用，以及植物MAPK信号途径、光合作用-天线蛋白、苯丙烷生物合成途径、类黄酮合成途径、卟啉和叶绿素代谢途径等，为解析血叶兰叶色形成分子机制提供了一定的科学依据。

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（责任编辑：冯" " 新）