芒果点斑螟不同发育阶段转录组及保幼激素和蜕皮激素相关基因分析

摘要：【目的】探明芒果点斑螟（Citripestis eutraphera）不同发育阶段的转录组差异，挖掘保幼激素（JH）和蜕皮激 素（Ecd）合成等生长发育相关基因，为芒果点斑螟特异性防治和研发环保型生长调节类杀虫剂打下基础。【方法】利用高通量测序技术对芒果点斑螟幼虫、蛹和成虫进行转录组测序、数据组装、功能注释和比较分析，筛选出JH和Ecd合成相关基因，并通过实时荧光定量PCR进行验证。【结果】芒果点斑螟幼虫、蛹和成虫3个阶段共组装得到254154条 Unigenes。幼虫与蛹阶段比较筛选出10688个差异表达基因（DEGs），幼虫与成虫阶段比较筛选出10041个DEGs，蛹 与成虫阶段比较筛选出12896个DEGs;将DEGs进行Nr数据库比对，结果显示与脐橙螟蛾（Amyelois transitella）的序 列相似度最高；进行GO功能注释分析，共注释到61266条Unigenes，各发育阶段芒果点斑螟的DEGs多富集在细胞结构体、细胞过程、催化活性和结合等过程；在KEGG数据库中共有14731条Unigenes得到注释，涉及147个代谢通路， DEGs富集在代谢过程、核糖体和氧化磷酸化过程等通路的数目较多，筛选出49条Unigenes涉及JH和Ecd合成相关基 因，对DIB、JHAMT、FPPP、ALDH-I和ALDH-2等5个DEGs进行实时荧光定量PCR分析，结果ALDH-I、ALDH-2DIB和 DIB在蛹期高表达，且相对表达量显著高于其他时期（P

关键词：芒果点斑螟；转录组；基因注释；保幼激素；蜕皮激素

文章编号：2095-1191（2024）03-0710-11

中图分类号：S436.679

文献标志码：A

Transcriptome analysis and juvenile hormone and ecdysone related genes of Citripestis eutraphera at differentdevelopmental stages

PENG Peng， TANG Ying-ying， QIN Yu-ming， YANG Shi-an， HUANG Guo-di，

LI Ri-wang， LUO Shi-xing， CHEN Yong-sen*

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute/Guangxi Engineering Research Center of Green and Efficient Development for Mango Industry/Guangxi Key Laboratory of Quality and Safety Control for Subtropical Fruits，Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： 【Objective】 To explore the transcriptome differences of Citripestis eutraphera at different developmental stages， and to explore the growth and development related genes such as juvenile hormone （JH） and ecdysone （Ecd）， so as to lay a foundation for the development of the specific prevention and control of C. eutraphera and the development ofenvironmentally friendly growth regulation insecticides. 【Method】High-throughput sequencing technology was used to perform transcriptome sequencing， data assembly， functional annotation and comparative analysis on the larvae， pupae and adults of C. eutraphera. The genes related to JH and Ecd synthesis were screened and verified by real-time fluores- cence quantitative PCR. 【Result】The results showed that a total of 254154 unigenes were obtained in the three stages of larvae， pupae and adults. A total of 10688 differentially expressed genes （DEGs） were identified by comparing the larval and pupal stages， and 10041 DEGs were screened by comparing the larval and adult stages. A total of 12896 DEGs were screened out from pupae and adults. The DEGs were compared with Nr database， and the results showed that the sequence similarity with the Amyelois transitella was the highest. GO functional annotation analysis was performed， and a total of 9786 Unigenes were annotated. The DEGs of C. eutraphera at different developmental stages were mostly enriched in cel- lular structure， cellular process， catalytic activity and binding. There were a total of 14731 unigenes being annotated in the KEGG database， involving 147 metabolism pathways， and most of them were enriched in metabolic pathways and ri- bosomes， oxidative phosphorylation processes. A total of 49 unigenes related to JH and Ecd synthesis were screened， of which DIB， JHAMT， FPPP， ALDH-1 and ALDH-2 DEGs were analyzed by real-time fluorescence quantitative analysis.ALDH-1，ALDH-2 and DIB expressed highly pupae stage，and the relative expression waw significantly higher than other stages （Plt;0.05， the same below），FPPP and JHAMT expression was low at larvae stage，and the relative expression was significantly lower than other stages. [Conclusion ]Based on transcriptome analysis， the DEGs of C. eutraphera at various developmental stages are mainly enrich in cellular structure， cellular process， and catalytic activity， with a predominant enrichment to metabolism-related pathways. A total of 49 genes related to JH and Ecd synthesis are screened out. The expression of DIB， JHAMT， FPPP， ALDH-1 and ALDH-2 genes displays significant variations across different developmental stages of C. eutraphera and potentially exert crucial roles in the growth and development of C. eutraphera.

Key words： Citripestis eutraphera; transcriptome; gene annotation; juvenile hormone; ecdysone

Foundation items： Guangxi Science and Technology Major Project （Guike AA22068098） ; Guangxi InnovationTeam Construction Project of China Agriculture Research System （nycytxgcxtd-2021-06-01） ; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（ Guinongke 2021YT141， Guinongke 2022YM22）

0 引言

【研究意义】芒果点斑螟（Citripestis eutraphera） 隶属于鳞翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae）斑螟 亚科（Phycitinae），主要分布在印度尼西亚、印度和 澳大利亚北部等地区，该虫于2014年在印度班加罗 尔市首次被报道（Singh et al.，2021），我国于2017年 在福建泉州口岸首次查获，寄主包括芒果、腰果和石 斛等（Hiremath et al.，2017）。其通过幼虫危害果实， 自果实中上部开始蛀蚀芒果果皮，随后向内蛀蚀果 肉，蛀口处有虫粪，导致果实落果，在印度卡纳塔克 邦对芒果Alphonso品种的平均危害率达30%（Ja- yanthi et al.，2015）。目前已在广西境内发现，通过形 态学分析和CO1基因比对分析后确认为芒果点斑 螟，是近年来新发现的芒果重要害虫之一。在昆虫生长发育过程中，保幼激素（Juvenile hormone，JH）与蜕皮激素（Ecdysone，Ecd）在昆虫组织凋亡重建等 变态发育生理活动中相互作用，实现对生长、蜕皮、 变态及生殖等生理活动的调控，因此，探究JH和Ecd 的合成代谢，可为害虫防治和环保型农药开发提供 靶标方向。【前人研究进展】高通量转录组测序可有效挖掘生物学性状与目的性状表达及遗传调控等功 能基因，已在多种鳞翅目昆虫不同发育阶段的分子 机制研究中应用，廖永林等（2020）对草地贪夜蛾雄 成虫和5龄幼虫进行转录组分析，发现解毒代谢相 关基因多处于下调状态；李亦松等（2021）在对梨小食心虫的成虫、蛹和幼虫进行转录组比较时筛选出 49个ABC转运蛋白基因来进行验证。此外，转录组 测序也应用于滞育和激素合成代谢等方面，张博等 （2020）筛选出伞裙追寄蝇滞育相关基因454个，其 中保幼激素酯酶显著下调82倍；李永丽等（2022）在 对桃小食心虫头部转录组测序中鉴定出7个与JH合 成代谢相关的基因。JH主要功能为保持幼虫特性， 遏制化蛹阶段的变态过程（胡冬春等，2023）。低水 平的JH可实现昆虫生殖滞育，在沉默异色瓢虫JH受体基因后，其生殖滞育发生，使用外源JH类似物处理后，生殖滞育解除（高俏，2021）。同时，成虫JH滴度还会影响雌虫生殖和交配等行为，当JH滴度增 加时，黏虫总产卵量、怀卵量和产卵历期均增加（李 泽，2022）。JH合成路径包括乙酰辅酶A（acetyl-CoA）、异戊烯醇焦磷酸（IPP）、法尼焦磷酸（FPP）和法尼酸（FA），最后法尼酸被细胞色素氧化酶和保幼激素酸甲基转移酶（JHAMT）等催化形成JH，在鳞翅目昆虫中JH存在形态为JHⅢ（柳鹏飞等，2021）。JHAMT作为JH合成通路的终端酶，是JH的限速酶之一，在家蚕5龄后期，JHAMT滴度降低，对家蚕JHAMT基因过表达后会出现幼虫阻滞等现象（张丽，2023）；此外，FPP作为倍半萜前体物质，已证明其是鳞翅目昆虫JH合成的限速酶之一，目前已被作为昆虫幼虫的杀虫靶标位点，沉默或喂食JHAMT和FPP酶抑制剂可使幼虫发育受阻，雌虫个体卵巢发育受阻，导致死亡（Liu et al.，2018;Picard et al.，2021）。Ecd是由昆虫体内的胆固醇通过22-羟化酶（Phantom CYP306A1）、2-羟化酶（Disembodied CYP302A1）和20-羟化酶（Shadow CYP315A1）催化 合成，主要调控幼虫蜕皮和末龄幼虫变态过程（林曼 婷等，2022），使用Ecd处理大猿叶甲和美洲棉铃虫 可解除其滞育过程（Reynolds et al.，2019;Guo et al.，2021）。在豆天蛾滞育形成过程中，Ecd大量增加，JH合成减少（郭明明等，2023）。【本研究切入点】芒 果点斑螟作为新发现的芒果害虫之一，目前国内外 未见对其进行转录组测序分析及对其JH和Ecd合 成代谢相关基因阐释的研究报道。【拟解决的关键问 题】通过对芒果点斑螟不同发育阶段转录组数据进 行功能注释，筛选生长发育相关基因，并对相关基因 进行差异表达分析，旨在鉴定出JH和Ecd合成相关 基因，为后续芒果点斑螟特异性防治和研发环保型 生长调节类杀虫剂打下基础。

1材料与方法

1.1试验材料

芒果点斑螟收集饲养于广西亚热带作物研究所 国家芒果种质资源保护广西创新基地内，于人工气 候培养箱中连续培养。饲养条件：温度（25±1）℃、相 对湿度（70+10）%，光周期L：D=16h：8h。

1.2总RNA提取

分别以芒果点斑螟健康3龄幼虫、蛹和成虫作 为试验组，各虫态分别选取3头放入1.5mL离心管， 将离心管浸入液氮中10min后取出置于-80℃冰箱保 存。采用TRIzol reagent试剂（美国Invitrogen公司） 对芒果点斑螟总RNA进行提取，使用RQ1酶消解DNA，稀释后通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和Nano- Drop 2000分光光度计（美国ThermoFisher Scientific 公司）检测对RNA进行质检。

1.3转录组测序与拼接组装

委托上海元莘生物医药科技有限公司采用 Hiseq 2000 Truseq SBS Kit v3（美国Illumina公司）高 通量测序平台进行转录组测序。通过Oligo（dT）磁 珠（美国Invitrogen公司）富集带有poly（A）尾的mRNA。随后在NEB Fragmentation Buffer中用二价 阳离子将得到的mRNA随机打断，按照NEB普通建 库方式建库。采用TruseqTMRNA sample prep Kit试 剂盒（美国IIlumina公司）进行文库构建，将测序所得的序列进行质控分析，去除Reads中的接头序列； 剪切前去除5'端含有非AGCT的碱基；修剪测序质 量较低的Reads末端（测序质量值小于Q20）；去除含 N比例达10%的Reads；舍弃接头及质量修剪后长度 小于25 bp的小片段；将过滤后的Clean reads利用 Trinity拼接得到转录本（Transcript），并筛选每个基因簇中最长的作为Unigene用于后续分析。得到 Unigenes后，对Nr、Swiss-Prot、STRING、GO、KEGG和Pfam等6大数据库的基因功能进行注释。

1.4差异基因筛选及功能注释

利用Hisat2和DESeq2进行试验组间基因表 达水平比较，以Plt;0.05筛选差异表达基因（Differen- tially expressed genes，DEGs）。采用clusterProfiler对 DEGs进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。

1.5实时荧光定量PCR验证

根据转录组测序分析结果，选择JH和Ecd合成通路上差异显著的5个基因，利用Primer Express 3.0设计特异性引物，以18SrRNA为内参（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（日本 TaKaRa 公司）对RNA进行反转录合成cDNA，采用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系10.0pL：cDNA模板1.0pL，上、下游引物（0.5μmol/L）各0.5μL， 2×SYBR GreenMix（日本TaKaRa公司）5.0 uL，ddH2O 补足至10.0pL。扩增程序：95℃预变性5min；95℃ 10s，60℃30s，进行44个循环；60℃5s至95℃5s 连续扫描，0.5℃作为1个梯度，扫描0.5s。芒果点斑螟幼虫、蛹和成虫各设置3个生物学重复，每个样本 进行3次重复试验。相对表达量采用2-4Ac法计算。

2结果与分析

2.1转录组测序质量数据统计

对芒果点斑螟9个样本的转录组进行分析，共 获得68.913 Gb的Clean data，各样本Clean data平均

数据量为7.657Gb，Q30碱基百分比在95.9613%以上，GC含量在45.0562%～50.4375%，数据可满足生物信息学分析相关要求。使用Trinity对所有样本Clean data进行从头组装，并对组装结果进行优化评估，结果显示，组装得到的Unigenes有254154条，GC含量为41.55%，N50平均长度有716bp。

2.2DEGs分析结果

芒果点斑螟转录组数据质控后将Unigenes与 GO、KEGG、Nr、Pfam、Swiss-Prot和STRING等多个 数据库比对，共有32493条Unigenes在至少1个数据库中获得功能注释，227条Unigenes在所有数据库中均能获得注释，有221661条Unigenes未得到注释信息（表2）。其中，Nr数据库中注释到的Unigenes数目最多，为30606条，占总Unigenes的12.04%；其次为KEGG数据库，注释到14731条Unigenes，占5.80%，涉及147个代谢通路；STRING数据库中注释到的Unigenes数目最少，为920条，占0.36%。

通过与Nr库比对，获得芒果点斑螟Unigenes序 列与近缘种属的近似情况并获得同源序列的功能 信息，共有30606条Unigenes获得注释（图1）。匹配较多的物种主要有脐橙螟蛾（Amyelois transitella） 和斜纹夜蛾（Spodoptera litura），分别占19.62%和 3.9%。可见，在转录组水平上芒果点斑螟与脐橙螟 蛾的序列相似度最高。

基于Unigenes的表达量定量结果进行试验组间 差异分析，获得2组间发生差异表达的Unigenes，幼虫与蛹阶段比较，筛选出10688个DEGs，其中表达 上调基因4654个，表达下调基因6034个；幼虫与成 虫阶段比较，筛选出10041个DEGs，其中表达上调 基因4522个，表达下调基因5519个；成虫与蛹阶段 比较，筛选出12896个DEGs，其中表达上调基因 6699个，表达下调基因6197个（图2）。

2.3DEGs的GO功能注释分析结果

GO功能注释分析结果显示，共有9768条芒果点斑螟Unigenes被划分为42个功能条目，其中生物学过程注释到的Unigenes最多，共有20个功能条目，占56.33%；分子功能注释到的Unigenes有14986条， 共有19个功能条目，占22.46%；细胞组分注释到的 Unigenes有3个功能条目，占19.42%（图3）。

通过不同阶段芒果点斑螟DEGs的GO功能注 释分析发现，DEGs多富集在细胞结构体、细胞过程、 催化活性和结合等过程，其中蛹到成虫过程富集在 细胞结构体的上调基因数量最多，为744个；从蛹到 成虫过程中，富集在发育过程的上调基因240个，下 调基因167个，幼虫到蛹过程中上调基因130个，下 调基因211个，幼虫到成虫过程中上调基因133个，下 调基因217个（表3）。涉及到Ecd生物合成过程的基因（Ecdysone biosynthetic process，go：0006697）有 7个，涉及到JH生物合成过程的基因（Juvenile hor- mone biosynthetic process，go：0006718）有4个。

2.4DEGs的KEGG信号通路富集分析结果

KEGG信号通路富集分析结果（图4）显示，共有14181个DEGs在KEGG数据库中注释成功，主要 分为六大类功能，包括代谢（7681个，54.16%）、有机系 统（458个，3.23%）、遗传信息处理（3100个，21.86%）、细胞过程（1407个，9.92%）、环境信息处理（1446个，10.20%）和人类疾病（89个，0.63%）（图4）。

DEGs富集在代谢过程、核糖体和氧化磷酸化过 程等通路的数目较多（图5）。在蛹到成虫过程， DEGs主要富集在核糖体、代谢过程、糖酵解和氨酰 tRNA生物合成等通路；在幼虫到蛹过程主要富集在 氨基酸生物合成、TCA循环和糖酵解等通路；在幼虫到成虫过程主要富集在氨基酸的生物合成、TCA循环和细胞色素P450药物代谢等通路。昆虫激素生 物合成通路在昆虫JH和Ecd生物合成中起重要作 用，本研究共检测到49条Unigenes涉及昆虫激素生物合成富集通路，其中包括32条Unigenes合成乙醛脱氢酶（ALDH）、11条合成保幼激素环氧水解酶 （JHEH）、1条合成蜕皮甾体2-羟化酶（DisembodiedCYP302A1）、1条合成保幼激素酸甲基转移酶（JHAMT）、1条合成法尼基磷酸酶（FPPP）和3条合 成其他酶类，为下一步鉴定芒果点斑螟生长发育因 子提供了研究基础。

2.5实时荧光定量PCR验证结果

以不同阶段芒果点斑螟cDNA为模板，选择JH和Ecd合成通路上差异显著的5个DEGs（DIB、JHAMT、FPPP、ALDH-1和ALDH-2）进行实时荧光定量PCR验证，结果（图6）显示，JHAMT基因在成虫体内表达量最高，与在幼虫体内的表达量差异 显著（Plt;0.05，下同），ALDH和DIB基因均在蛹过程中表达量显著高于幼虫和成虫，FPPP基因在蛹过 程中的表达量最高，与成虫体内的表达量差异不 显著（Pgt;0.05），但显著高于在幼虫体内的表达量。

3讨论

芒果点斑螟作为近年来新发现的害虫，目前已 在广西南宁和百色境内发生，且有逐步向贵州和云 南蔓延的趋势。本研究对芒果点斑螟幼虫、蛹和成 虫进行了转录组测序，共得到254154条Unigenes，基因功能注释结果显示，共有32493条Unigenes在至少1个数据库中得到注释，221661条Unigenes未 得到注释信息，可能由于部分序列组装长度过短，或 未知基因非编码序列。

在GO功能注释分析中，不同发育阶段的DEGs 多富集在细胞结构体、细胞过程、催化活性和结合等 过程中，说明相关细胞活动可以对各种物质进行转 运和信号传递交流（Zhao，2020），可影响昆虫的整个 发育阶段。催化活性为分子功能中最多的富集功能， 主要参与芒果点斑螟发育阶段各类酶的催化（Gau-tam et al.，2020）。KEGG信号通路富集分析显示，氧 化磷酸化和核糖体通路在芒果点斑螟3个生长阶段 均富集较多，氧化磷酸化是生物体分解过程中释放 能量和合成ATP的重要途径，核糖体蛋白主要参与 蛋白质的合成转录和细胞凋亡等生理过程。幼虫到蛹阶段，幼虫生长速度加快，DEGs在脂肪酸代谢及 脂肪酸降解通路富集，说明可能与昆虫加快组织新 陈代谢有关，同时脂肪酸也是形成细胞膜的成分之 一（王宇翔等，2022）；幼虫到蛹和成虫阶段，KEGG信号通路富集分析结果显示，DEGs主要富集在氨基 酸、糖类、脂类和蛋白质等物质合成代谢等过程，推测由于化蛹阶段需要大量能量，因此加快了糖类、脂 类和蛋白质等物质的代谢，用于维持蛹阶段体内能 量供给和消耗（Chen et al.，2017）；幼虫到成虫阶段 DEGs主要富集在氨基酸生物合成和细胞色素P450 药物代谢等通路，这些富集通路对幼虫到成虫生长 发育过程中器官的功能、结构稳定和生理生化功能 完善有重要作用（Liu et al.，2014）。此外，钙信号通 路共注释到165个基因，主要功能为与内质网和线 粒体上的钙离子通道控制Ca²+的释放和进入，可能参与JH和Ecd的运输调控等功能（李欣等，2023）。JH在调控昆虫生长和变态发育中发挥重要作 用（洪芳等，2016），在昆虫化蛹前JH水平下降，幼虫才能正常化蛹，JHAMT作为昆虫合成JH的终端酶（Zhang et al.，2016；陈金霞等，2023），其趋势与昆虫体内JH滴度变化基本一致。在桔小实蝇、黑腹果蝇和 马铃薯甲虫中，JHAMT基因（BdjJHAMT、DmjJHAMT 和LdjJHAMT）的表达量在幼虫阶段表达量极低，进入化蛹阶段开始上升（Fu et al.，2016；周琪皓，2021），在本研究中，JHAMT基因在芒果点斑螟幼虫阶段低表达，蛹和成虫阶段高表达，与Fu等（2016）和周琪皓（2021）的研究结果一致，证明JHAMT在昆虫合成JH的限速酶之一，在扁角豆芫菁1～3龄幼虫 中含量较低，与蛹和成虫含量差异显著（周治成， 2022），本研究结果与之类似。DIB是由酮二醇转化为Ecd时4个羟化酶之一（柳鹏飞等，2021），在意大利蝗卵中，DIB和蜕皮激素受体（EcR）一起参与其发育调控，其在卵滞育阶段高表达（赵娜等，2023），而 在本研究中，DIB基因在蛹期高表达，显著高于其他发育阶段，说明DIB基因可能参与幼虫到蛹之间器 官转变和成虫器官形成等过程（林曼婷等，2022）。 但由于本研究未采用末龄幼虫作为试虫，因此DIB 和FPPP基因在末龄幼虫体内表达量仍需进一步 研究。

4结论

本研究通过不同发育阶段芒果点斑螟的转录组 分析，发现DEGs多富集在细胞结构体、细胞过程、 催化活性和结合等过程，且主要富集在代谢相关 通路中，同时筛选出49条与JH和Ecd合成相关的基因，其中DIB、JHAMT、FPPP、ALDH-1和ALDH-2等 基因在芒果点斑螟不同发育阶段表达差异显著，可 能在芒果点斑螟生长发育中发挥重要作用。

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（责任编辑麻小燕）