油桐ARF基因家族的鉴定及表达分析

摘要： 植物生长发育由多种激素共同调控，其中生长素是重要的调控激素之一。生长素响应因子（Auxin response factor，ARF）是生长素信号传导过程中的关键因子，它能够特异性地与生长素应答元件结合，进而影响植物体内生长素响应基因的表达。本研究通过生物信息学方法鉴定到17个油桐ARF基因家族成员，分布在9条染色体上，并且各基因间无片段重复现象。理化性质分析结果表明，ARF蛋白长度为587～1 119 aa，均为酸性蛋白质，不稳定系数＞40，为不稳定蛋白质，亲水性指数＜0，为亲水性蛋白质。根据系统进化分析结果将油桐ARF蛋白家族分为4个亚族，与拟南芥的亚族划分一致。每个成员都具有典型的B3型结构域和Auxin_resp中间结构域。分析ARF基因表达特征发现，ARF基因的表达在油桐不同组织中具有明显的组织特异性。本研究结果为揭示油桐生长发育调控机制提供了理论依据。

关键词： 油桐；ARF基因家族；生物信息学分析；表达分析

中图分类号： S794.3"" 文献标识码： A"" 文章编号： 1000-4440（2024）06-0984-09

Identification and expression analysis of ARF gene family in Vernicia fordii

WANG Zhanjun1，2， LI Jingjing1， ZHOU Zihan1， SUN Wan1， WANG Yi1， ZHANG Xie2

（1.School of Biology and Food Engineering， Hefei Normal University， Hefei 230601， China；2.State Key Laboratory of Utilization of Woody Oil Resource， Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， China）

Abstract： Plant growth and development is regulated by many hormones， among which auxin is one of the important regulatory hormones. Auxin response factor （ARF） is a key factor in the process of auxin signal transduction， which can specifically bind to auxin response elements and affect the expression of auxin response genes in plants. In this study， 17 members of ARF gene family in Vernicia fordii were identified by bioinformatics method， which were distributed on nine chromosomes， and there was no fragment duplication between genes. The results of physical and chemical properties analysis showed that the length of ARF proteins was 587-1 119 aa， all of them were acid proteins. The instability coefficients of ARF proteins were more than 40， and the ARF proteins were unstable proteins. The hydropathicity indexes of ARF proteins were less than 0， and the ARF proteins were hydrophilic proteins. According to the results of phylogenetic analysis， the ARF protein family of Vernicia fordii was divided into four subfamilies， which was consistent with the subfamily division of Arabidopsis thaliana. Each member had a typical B3 domain and an auxin_resp intermediate domain. By analyzing the expression characteristics of ARF gene， it was found that the expression of ARF gene had obvious tissue specificity in different tissues of Vernicia fordii. The results of this study provide a theoretical basis for revealing the regulatory mechanism of Vernicia fordii growth and development.

Key words： Vernicia fordii；ARF gene family；bioinformatics analysis；expression analysis

油桐（Vernicia fordii）为大戟科（Euphorbiaceae）油桐属落叶乔木树种，其整株都具有极高的应用价值，根、叶、花、果均可入药[1]；并且油桐既有能源和经济价值，又是重要的用材树种[2]。

植物生长素响应因子（Auxin response factor，ARF）是生长素信号传导过程中的关键因子，其能够特异性地结合生长素应答元件，从而影响植物体内生长素响应基因的表达[3]。植物生长素调控涉及多个基因家族，机制十分复杂，对生长素响应因子的研究有助于揭示植物生长发育调控机制。ARF基因在多种植物中的功能已被揭示。例如，在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）研究中发现，AtARF17促进花药发育和花粉管壁形成[4]，AtARF1和AtARF2参与花器官的发育和凋谢过程[5]，AtARF6和AtARF8促进花器官成熟[6]。葡萄（Vitis vinifera）中VvARF7基因能响应红蓝光，促进花芽分化[7]。另外，ARF基因家族还在植物抗逆境胁迫响应中发挥着重要作用。冷胁迫条件下，香蕉（Musa acuminata）中17条MaARF基因被诱导，26条MaARF基因被抑制[8]。下调SlARF4表达，番茄（Solanum lycopersicum）的抗盐和抗干旱能力增强[9]。通过对二穗短柄草（Brachypodium distachyo）的研究，发现BdARF4和BdARF8基因均参与了水杨酸信号通路调控，可以缓解重金属胁迫[10]。

目前，油桐全基因组数据测序已经完成，但对于油桐ARF转录因子的相关研究却鲜见报道。因此，本研究利用生物信息学技术，基于油桐全基因组数据鉴定出油桐ARF基因家族成员，并对油桐ARF基因家族进行系统分析，旨在阐释生长素响应因子ARF在油桐生长发育进程中的功能与作用机制。

1 材料与方法

1.1 基因序列来源

油桐全基因组数据[11]来源于中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室（https：//bigd.big.ac.cn/gsa/）；在拟南芥数据库网站TAIR（http：//www.arabidopsis.org）下载拟南芥ARF蛋白氨基酸序列；水稻（Oryza sativa）的ARF蛋白氨基酸序列下载自NCBI数据库网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；巨桉（Eucalyptus grandis）、麻疯树（Jatropha curcas）和蓖麻（Ricinus communis）的ARF蛋白氨基酸序列下载自Plant TFDB 数据库网站（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn）。

1.2 油桐ARF基因家族成员的鉴定及其编码蛋白质理化性质分析

首先，从Pfam网站（http：//pfam.xfam.org/）下载ARF基因家族的隐马尔科夫模型文件（PF06507）[12]，再使用HMMER3.0软件对油桐ARF转录因子家族成员进行搜索，筛选出候选序列[13]。其次，利用本地BLASTP软件比对拟南芥ARF基因与油桐基因组序列，选取E值lt;1×10-10的序列。针对两种方法获得的重复氨基酸序列只需保留其一，初步确定油桐的ARF基因家族成员。之后借助SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）进一步确认ARF蛋白保守结构域[14-15]。最终鉴定得到ARF基因家族成员，并根据BLAST命名法和系统命名法，对油桐ARF基因进行命名。

对油桐ARF基因家族成员编码的蛋白质氨基酸序列应用在线软件ProtParam[16]（http：//web.expasy.org/protparam/）进行预测分析，分析其相对分子量（Relative molecular weight）、等电点（Isoelectric point）、不稳定性系数（Instability index）、亲水性指数（Hydropathicity index）、脂溶指数（Aliphatic index）等理化性质，油桐ARF蛋白的亚细胞定位分析利用Plant-mPLocserver在线网站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）[17]。

1.3 ARF家族的系统发育分析

利用软件MEGA 11[18]对油桐、拟南芥、水稻、巨桉、麻疯树和蓖麻的ARF蛋白进行多序列分析比对，比对结果利用邻近法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，使用泊松校正法计算进化距离，校验参数（Bootstrap）为1 000，其余参数设置为初始的默认值。最后通过Evolview（http：//www.evolgenius.info/evolview/#/）在线美化进化树。

1.4 油桐ARF基因家族的基因及其编码蛋白质结构分析

将已鉴定出的油桐ARF的CDS序列和对应的基因组DNA序列上传至基因结构显示网站[19]（http：//gsds.gao-lab.org/），在线分析其基因结构特征。

运用MEME[20]在线工具分析该家族的蛋白质基序，最大基序检索数目设置为10，其他参数均为默认值。随后通过TBtools[21]软件获得可视化呈现。对筛选得到的油桐各ARF蛋白的保守结构域采用在线软件SMART分析，并利用TBtools软件进行作图。

1.5 油桐ARF基因家族成员的染色体定位

借助TBtools程序的GENE定位功能对油桐中筛选出的ARF基因进行染色体定位。

1.6 油桐ARF基因家族的基因表达分析

收集油桐不同生长时期、不同组织的转录组数据[22]，包括开花后10 周的种子（S1）、开花后15周的种子（S2）、开花后20周的种子（S3）、开花后25周的种子（S4）、开花后30周的种子（S5）；不同发育时期的花蕾：开花前30 d的雌蕾（C1）和雄蕾（X1）、开花前20 d的雌蕾（C2）和雄蕾（X2）、开花前10 d的雌蕾（C3）和雄蕾（X3）、开花前1 d的雌蕾（C4）和雄蕾（X4）；8年生油桐的根（root）、茎（stem）、叶（leave）。在转录组数据库中检索17个油桐ARF基因的表达值（FPKM），并使用TBtools软件中的Heat Map模块绘制差异表达热图。

2 结果与分析

2.1 油桐ARF基因家族成员的鉴定结果及其编码蛋白质理化性质

首先利用隐马尔可夫模型和BLASTP算法对油桐全基因组进行搜索，筛选出油桐的ARF基因序列。在此基础上，通过交叉筛选以及保守结构域的筛选（去除不含Auxin_resp结构域的蛋白质氨基酸序列），最终共鉴定出17个油桐ARF基因家族成员。与其他物种ARF基因研究结果相比，本研究鉴定出的油桐ARF基因家族成员数量比水稻、拟南芥、大豆（Glycine max）等物种略少，与巨桉、麻疯树、蓖麻等物种ARF基因家族成员数量一致。

油桐ARF蛋白基本理化性质如表1所示，17个油桐ARF蛋白氨基酸序列长度为587～1 119 aa，其中VfARF17最短，VfARF19A最长。蛋白质相对分子量为64 510.90～124 993.45，其中VfARF17相对分子量最小，VfARF19A相对分子量最大。理论等电点为5.10～6.93，表明17个ARF蛋白等电点＜7，属酸性蛋白质。油桐ARF蛋白不稳定系数为47.86～74.30，不稳定系数＞40，均属于易分解的不稳定蛋白质。油桐ARF蛋白亲水性指数为-0.684～-0.262，亲水性指数＜0；亲水性指数为负值时表示为亲水性，反之，正值时则表示为疏水性，表明油桐ARF蛋白都是亲水性蛋白。亚细胞结构定位预测结果显示，油桐ARF蛋白均位于细胞核中。

2.2 ARF家族的系统发育树

为揭示ARF家族的系统进化关系，选取6个物种：拟南芥（23条ARF蛋白）、油桐（17条ARF蛋白）、水稻（25条ARF蛋白）、巨桉（17条ARF蛋白）、麻疯树（17条ARF蛋白）、蓖麻（17条ARF蛋白）构建系统发育树，其中水稻为单子叶植物的典型代表，拟南芥为双子叶植物的典型代表。进化树聚类分析结果（图1）显示，油桐ARF家族成员可分为Ⅰ亚族、Ⅱ亚族、Ⅲ亚族和Ⅳ亚族这4个亚族。其中Ⅰ亚族中含有6个油桐ARF蛋白家族成员，分别为VfARF2A、VfARF2B、VfARF1、VfARF24、VfARF9B、VfARF9A；Ⅱ亚族中含有2个油桐ARF蛋白家族成员，分别为VfARF4、VfARF3；Ⅲ亚族含有5个油桐ARF蛋白家族成员，分别为VfARF5、VfARF6、VfARF8、VfARF19A、VfARF19B；Ⅳ亚族含有4个油桐ARF蛋白家族成员，分别为VfARF17、VfARF16B、VfARF10、VfARF16A。值得注意的是，在I亚族中，存在一个分支仅包含EgrARF24、VfARF24和JcARF10。该分支没有草本一年生植物（如拟南芥、水稻）的ARF蛋白家族成员，但包含木本多年生植物（如巨桉、油桐、麻疯树）的ARF蛋白家族成员。研究结果表明，油桐与麻疯树和蓖麻之间存在较多的相似蛋白质，油桐的ARF蛋白均可在麻疯树和蓖麻中找到对应的同源蛋白质氨基酸序列。

2.3 油桐ARF基因结构

将油桐ARF的CDS序列及其对应的基因序列按要求提交至在线网站GSDS2.0进行基因结构分析，由图2可知，油桐ARF基因结构复杂多样，均含有较多的外显子与内含子。此外，VfARF16A与VfARF16B基因结构上相似度较高，VfARF19A与VfARF19B基因结构上相似度较高。

2.4 油桐ARF蛋白保守基序

利用在线软件MEME预测油桐ARF蛋白质的保守结构域，结果如图3所示，亲缘关系较近的成员表现出相似的保守基序特征。VfARF17含有8个保守基序，VfARF1、VfARF3、VfARF9A、VfARF9B和VfARF10含有9个保守基序，其他序列均含有10个保守基序。油桐ARF蛋白都具有6个相同的Motif，Motif 4、Motif 2、Motif 1、Motif 6、Motif 5、Motif 10。由此可推测，油桐ARF基因家族成员在功能上具有一定的相似性。

2.5 油桐ARF家族蛋白质保守结构域

油桐ARF家族蛋白质保守结构域分析结果见如图3所示，可以看出，同一亚族蛋白质的保守结构域的组成和排序具有一定的相似性。Ⅰ亚族和Ⅱ亚族中，除VfARF2B和VfARF3编码的蛋白质含有B3和Auxin_resp 2个结构域外，其他成员均含有B3、Auxin_resp和AUX_IAA 3个结构域，Ⅲ亚族中的全部成员均含有B3结构域、Auxin_resp结构域和AUX_IAA结构域。此外，Ⅳ亚族中的全部成员均不包含AUX_IAA结构域，推测Ⅳ亚族的油桐ARF基因在进化历程中或许出现部分丢失现象。总的来看，大部分油桐ARF蛋白含有完整的3个结构域，即B3结构域、Auxin_resp结构域和AUX_IAA结构域。各亚族的ARF蛋白保守结构域差别较小，所有油桐ARF蛋白均含有B3和Auxin_resp结构域。

2.6 油桐ARF基因家族成员的染色体定位

依据油桐基因组注释文件，结合TBtools分析油桐ARF基因的染色体定位，油桐ARF基因在各个染色体上的分布较均匀（表1），17个VfARF基因分布在9条染色体上，6号和8号染色体上各有3个VfARF基因，1号、2号、4号、5号染色体上各有2个VfARF基因，3号、7号和9号染色体上各有1个VfARF基因。VfARF10、VfARF4、VfARF1、VfARF16B、VfARF19B、VfARF2A位于染色体的上端，VfARF16A、VfARF8、VfARF9B、VfARF24、VfARF9A、VfARF3、VfARF6、VfARF2B、VfARF19A、VfARF17、VfARF5位于染色体的下端。此外，在油桐ARF基因家族成员中未发现有串联重复和片段重复现象。

2.7 油桐ARF基因表达

由图4可知，在开花后10周，油桐种子中VfARF2A、VfARF9A、VfARF2B、VfARF4表达量较高。在开花后15周，油桐种子中VfARF2A的表达量最高。在开花后20周，油桐种子中VfARF9A的表达量最高。随着种子的生长和发育，VfARF24基因表达量逐渐升高，但 VfARF24基因在根、茎、叶、花中几乎不表达。在开花前30 d ，雌蕾和雄蕾中VfARF5、VfARF6、VfARF8、VfARF9A、VfARF2A和VfARF2B表达量较高。在开花前20 d，雄蕾中VfARF6、VfARF8和VfARF2B表达量较高，雌蕾中VfARF6、VfARF8、VfARF2B、VfARF2A和VfARF9A表达量较高。在开花前10 d，雄蕾中VfARF6、VfARF8和VfARF2B表达量较高，雌蕾中VfARF6、VfARF8、VfARF2B表达量较高。推测这些基因可能与花器官的成熟与发育有关。VfARF6和VfARF2A在茎部表达量较高。在根部，VfARF2A和VfARF9B的表达量较高，其中VfARF2A的表达量最高，表明其可能参与调控根部生长和发育。叶片中VfARF2B、VfARF6、VfARF2A的表达量较高。值得注意的是，VfARF19A和VfARF10仅在开花前1 d的雄蕾中表达量大幅上调，推测这2个基因可能与雄蕾后期的发育有关。油桐ARF基因在雌蕾和雄蕾中的表达量明显高于其在根、茎、叶和种子中的表达量。此外，VfARF16A、VfARF16B、VfARF17基因在油桐各组织中表达量都较低。综上所述，ARF基因的表达在油桐不同组织中表现出了明显的组织特异性。

3 讨论

本研究通过对油桐全基因组进行生物信息学分析，鉴定出17个油桐ARF基因，这与麻疯树，巨桉和蓖麻的ARF基因家族成员数量一致。结合已报道的研究结果，发现ARF基因家族成员的数量在不同物种中有明显的差异，如拟南芥中有23个ARF基因[23]、烟草（Nicotiana tabacum）中有50个ARF基因[24]、水稻中有25个ARF基因[25]、番茄中有21个ARF基因[26]、大豆（Glycine max）中有51个ARF基因[27]、苹果（Glycine max）中有29个ARF基因[28]、桃（Prunus persica）中有18个ARF基因[29]、葡萄中有19个ARF基因[30]、南瓜（Cucurbita moschata）中有18个ARF基因[31]、黄瓜（Cucumis sativus）中有15个ARF基因[32]、茶树（Camellia sinensis）中有25个ARF基因[33]、巨桉中有17个ARF基因[34]、麻疯树中有17个ARF基因[35]。尽管不同物种的基因组大小差异较大，但不同植物中ARF的数量与它们的基因组大小并无直接关系。

油桐ARF蛋白氨基酸序列长度为587～1 119 aa，相对分子量为64 510.90～124 993.45，均为酸性蛋白质。由于所有油桐ARF蛋白的不稳定系数＞40，且亲水性指数＜0，故它们均属于不稳定、易降解的亲水性蛋白。油桐ARF蛋白的亚细胞定位结果与其他物种略有不同，例如梅（Prunus mume）PmARF17蛋白位于细胞核和细胞膜上[36]，而油桐ARF蛋白仅存在细胞核中。染色体定位分析结果表明，油桐ARF基因在不同染色体上的数量分布较为均匀，17个油桐ARF基因定位在9条染色体上，平均每条染色体上含有1～3个油桐ARF基因，并且在各染色体上均未发现串联重复和片段重复的情况。系统进化关系分析发现，油桐ARF家族成员可划分为4个亚族，这与拟南芥的亚族划分一致。其中I亚族是该家族中成员数量最多的一支，共有6个油桐ARF基因成员；Ⅱ亚族中含有的油桐ARF基因家族成员最少，仅有2个油桐ARF基因成员。分析油桐ARF基因及其编码蛋白质结构发现，油桐ARF均含有外显子和内含子且结构复杂多样，亲缘关系较为密切的成员表现出相似的保守基序特征，这表明在物种进化过程中ARF存在一定的保守性。基因家族成员保守结构域分析结果显示，同一亚族的保守结构域的组成和排序往往呈现出相似的特征。油桐的大多数ARF蛋白都含有B3、Auxin_resp和AUX_IAA结构域，仅少数的油桐ARF蛋白表现出不同于其他成员的AUX_IAA结构域缺失现象，这与黄贤斌等[37]对石榴（Punica granatum ）ARF蛋白家族的鉴定结果相似。值得注意的是， Ⅳ亚族的所有成员均不包含AUX_IAA结构域，可以推测Ⅳ亚族的油桐ARF基因在进化历程中或许发生了部分丢失的现象。生长素/吲哚乙酸（Aux/IAA）蛋白质通常与ARF蛋白C末端的AUX_IAA结构域结合形成异源二聚体，进而参与生长素信号途径，发挥着生长素调控作用[38]。据此推测油桐ARF蛋白的AUX_IAA结构域丢失可能会对其生理功能产生影响。

基因表达特征为基因功能研究提供重要信息。本研究发现部分油桐ARF基因在多种组织中皆高表达，如VfARF5、VfARF6、VfARF8、VfARF9A、VfARF2A和VfARF2B，暗示它们可能在油桐的生长发育中发挥着多方面的重要作用。部分基因在各组织中不表达或表达量过低，有些基因则主要在一个组织中表达量很高，表明ARF基因在油桐不同组织中的表达具有显著的组织特异性。此外，油桐ARF基因在雌蕾和雄蕾中的表达水平明显高于其在根、茎、叶和种子中的表达水平，石榴中也出现PgARF6a、RgARF6b、PgARF6c在花、花芽中较高表达现象[6，39]，表明在花器官的发育和成熟过程中ARF基因或将发挥重要作用。

本研究在油桐全基因组中共鉴定到17个油桐ARF基因，对其基因结构、系统发育、染色体定位及其编码蛋白质基本的理化性质、亚细胞定位、保守结构域、保守基序进行了系统的生物信息学分析。此外，基于油桐在不同发育阶段的花、种子和营养组织的转录组数据，对油桐ARF基因的表达特征开展了全面研究。本研究结果为阐释生长素响应因子ARF在油桐生长发育过程中的功能和作用机制提供了理论支持，同时也为研究其他植物中的植物生长素响应因子ARF提供参考信息。

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（责任编辑：成纾寒）

收稿日期：2024-02-05

基金项目：省部共建木本油料资源利用国家重点实验室开放课题（GZKF202103、GZKF202203）；安徽省高校优秀青年人才支持计划项目（gxyq2020040）；安徽省级大学生创新创业训练计划项目（S202414098204、S202414098205）；国家级大学生创新创业训练计划项目（202414098077）;2022年度引进高层次人才科研启动基金项目（2022rcjj12）

作者简介：王占军（1984-），男，安徽寿县人，博士研究生，从事植物细胞分子生物学研究。（E-mail）wangzhanjunhxj@163.com。李静静为共同第一作者。

通讯作者：张 勰，（E-mail）zhangxiei3@163.com