国内外蜡样芽胞杆菌检测标准对比分析

摘 要：蜡样芽胞杆菌是引起食源性疾病群体事件的一种主要致病菌，其产生的毒素会引起呕吐或腹泻。本文对比分析国内外蜡样芽胞杆菌检测标准，以期为我国蜡样芽胞杆菌检测标准体系进一步发展提供参考。

关键词：蜡样芽胞杆菌；检测；标准

Comparative Analysis of Domestic and Foreign Testing Standards for Bacillus cereus

HAN Jiangxue

（Hebei Province Pharmaceutical Professional Inspector Corps （Southern region）， Shijiazhuang 050011， China）

Abstract： Bacillus cereus is a major pathogen causing foodborne illness in mass incidents， producing toxins that can cause vomiting or diarrhoea. In this paper， the detection standards of Bacillus cereus at home and abroad were compared and analyzed， in order to provide a reference for the further development of the detection standard system of Bacillus cereus in China.

Keywords： Bacillus cereus; detection; standard

蜡样芽胞杆菌，杆状，兼性需氧，产芽孢，革兰氏阳性菌，其产生的毒素会引起呕吐或腹泻，该症状通常较轻且持续时间很短（约24 h）。蜡样芽胞杆菌通常存在于土壤环境以及各种食物中，其芽孢能够在包括正常烹饪温度在内的恶劣环境中生存。

早餐谷物食品和婴儿谷物食品被认为是低水分含量的食品（Low Moisture Foods，LMF），主要特点是水分活度（Water Activity，Aw）低，有助于延长食品的保质期，从微生物对食品安全影响的角度来看，这类食品并不能引起人们的重视。一般而言，微生物在低水分含量的食品中较难生长，但一旦这些食品受到污染，相关微生物便可以长期存在。针对不同的微生物物种，其生长或致病的方式不同。例如，部分微生物的轻微污染（沙门氏菌）即可导致疾病；不稳定的储存温度可导致微生物致病性的产生（蜡样芽胞杆菌）[1]。

蜡样芽胞杆菌可导致食物中毒，引起食源性疾病群体事件，主要引发两种症状，即腹泻与呕吐。根据“支持微生物风险管理的低水分食品排名”的报告[1]，蜡样芽胞杆菌是谷物及其制品中由于致病率、流行性和感染病例而最常被调查的致病微生物，该报告中还强调，蜡样芽胞杆菌是引起美国、澳大利亚、新西兰等不同国家和地区44次疫情（其中31次是由大米制品引起的）的主要原因，其中一次疫情涉及婴儿谷物食品。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO）的meta-analysis报告中指出，蜡样芽胞杆菌在谷物类制品及干谷物中的平均致病率为41.7%[1]。2015年，闫韶飞等[2]对我国市售婴配乳粉中蜡样芽胞杆菌的污染程度及其毒力基因进行研究，结果表明，在135份婴配乳粉样本中有57份样本检出蜡样芽胞杆菌，检出率为42.22%，其平均污染值为7.14 MPN·g-1。有学者分析2011—2019年吉林省3 173份食品样品蜡样芽胞杆菌污染状况，发现蜡样芽胞杆菌总检出率为23.6%（750/3 173），其中乳与乳制品检出率为39.3%（114/290），婴幼儿配方食品检出率为31.1%（185/595）[3]。

本研究通过检索国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）、美国细菌学分析手册（Bacteriological Analytical Manual，BAM）、我国蜡样芽胞杆菌检测方法相关标准，对检测技术和要求进行比较分析，以期为我国蜡样芽胞杆菌检测标准体系进一步发展提供参考。

1 国内外蜡样芽胞杆菌检测标准及其特点

1.1 ISO

ISO是一个独立的非政府国际组织，出台了ISO 7932：2004，并且在2020年8月发布了修订稿1——可选实验。该修订稿描述了对前期分离获得的蜡样芽胞杆菌菌株进行补充研究（即流行病学研究），检测细胞毒素K的cytK-1或cytK-2基因变异，对能够产生呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌菌群的检测，炭疽芽孢杆菌筛查的运动测试，并提出了苏云金芽孢杆菌蛋白质结晶的镜检方法等[4]。该方法中明确了本标准的适用范围，即用于推定在30 ℃时蜡样芽胞杆菌菌落计数的方法，在实验前期仅采用了MYP琼脂和溶血实验两种，故选用了“推定”这一词汇，表明在该验证阶段可能不会将蜡样芽胞杆菌与其他相关但并不常见的芽孢杆菌区分开。在此标准的修正案中，用术语“蜡样芽胞杆菌菌群”代替了“推定的蜡样芽胞杆菌”，如EFSA在2016年发表的科学意见中所解释的，因为它在科学上表述更为精确[5]。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法应用在蜡样芽胞杆菌菌群分离株中检测细胞毒素K的cytK-1或cytK-2基因变异并鉴定有细胞毒性的蜡样芽胞杆菌。cytK-2基因位于染色体上并编码的细胞毒素K，产生肠毒素，广泛存在于苏云金芽孢杆菌和蜡样芽胞杆菌菌株[6]。cytK-1基因是cytK-2基因的变体，由于该基因存在显著的多态性，可以编码具有更强细胞毒性的细胞毒素K且仅存在于细胞毒素芽孢杆菌（B. cytotoxicus）细胞中[7]，见图1。该补充方法表明，PCR测定可以检测细胞毒素K基因（特别是其两个变体中的一个）和鉴定B. cytotoxicus菌株，这两个特征均与食物中毒有关。

针对含有ces基因、能够产生呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌菌群的检测，分别采用琼脂糖凝胶电泳PCR和实时PCR两种方法。运动性测试可在分离出的蜡样芽胞杆菌中区别出炭疽芽孢杆菌，但该检测方法仍具有较强的局限性，不能有效区分蕈状和炭疽两种芽孢杆菌。

1.2 BAM

美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）制定的BAM包含其对食品和化妆品微生物分析的首选实验室方法。第十四章中说明了蜡样芽胞杆菌的两种检测方法：平板计数法和最可能数法（Most Probable Number，MPN）法。其中增加了耐低温测试和对呕吐毒素进行定量分析的方法。

BAM中指出，MYP琼脂一直是接种蜡样芽胞杆菌的标准培养基，但是选择性极低，因此背景菌群不能被有效抑制，可能会掩盖潜在的蜡样芽胞杆菌。本方法同时选用了一种兼有显色性和选择性的琼脂培养基——Bacara培养基，它可促进蜡样芽胞杆菌的生长并会抑制背景菌群[8]。

针对区分蜡样芽胞杆菌的典型菌株与蜡样芽胞杆菌菌群中其他菌株的实验中，设置了耐低温菌株测试。为了测定待测菌株的耐低温性，在两块TSA平板上划线。一个平板在6 ℃孵育28 d，另一个在43 ℃孵育4 d。魏登施泰芽胞杆菌（B. weihenstephanensis）菌株会在6 ℃生长，但不会在43 ℃生长。在方法的最后增加了对与某些蜡样芽胞杆菌菌株相关的呕吐毒素进行定量分析的方法。

1.3 中国国家标准以及出口食品检测方法

《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》（GB 4789.14—2014）中规定了两种检测方法：平板计数法及MPN法[9]。《出口食品中蜡样芽胞杆菌检测方法》（SN/T 0176—2013）在平板计数法及MPN法基础上增加了可替代生化实验的生化鉴定试剂盒或全自动生化鉴定系统。上述两个相关标准中，对样品取样量均规定为25 g，在GB 4789.14—2014中对接种量有详细而明确的规定，根据样品污染状况的预估，选择2～3个适宜、连续稀释度的样品匀液，分别接种MYP琼脂平板，每个稀释度接种量分别为0.3 mL、0.3 mL和0.4 mL。

2 国内外蜡样芽胞杆菌检测标准比较

国内外采用培养法检测蜡样芽胞杆菌的差异比较情况见表1。ISO 7932：2004中未提及MPN法且在生化实验部分选择的实验种类较少，但要求进行蛋白质毒素结晶实验、呕吐毒素检测和毒力基因检测。在苏云金芽孢杆菌的蛋白质毒素结晶油镜检查规程中，特别强调了从细菌细胞中释放出来之后这些蛋白质毒素结晶很难与其他包含体区分开，因此应当在其仍与芽孢一起存在于细菌细胞内时进行观察，这一方法与国标法在操作和判定时存在一定区别。

ISO和BAM都针对呕吐毒素检测的详细方法进行了说明，而我国国家标准对该方面没做要求。在毒力基因检测方面仅有ISO标准中有明确规定，其他两项标准中均未涉及，但该结果仅表明可能存在潜在的风险，仅通过基因鉴别或种属鉴定无法确认cytK基因的表达情况。

在蜡样芽胞杆菌不同菌株硝酸盐还原试验中，国标中标注的“+/-”符号表示大多数的菌株阳性，而在BAM中该符号表示50%的菌株呈阳性，且在硝酸盐还原实验中两个方法给出了不同的判定说明。因此，依据不同标准进行生化结果判定时，要特别注意判定说明不同带来的结果差异性。详见表2。

进出口行业标准SN/T 0176—2013的培养法与国标一致，提出了可替代的生化实验，选用API 50 CHB生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统进行鉴定[10]。《出口食品中蜡样芽胞杆菌快速检测方法 实时荧光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中，采用了传统的PCR检测分析方法，利用蜡样芽胞杆菌区别于其他种芽孢杆菌的特异位点进行检测[11]，与ISO相比较还欠缺关于菌种鉴定基因、毒力基因分析等检测信息，缺乏针对进出口行业快速、高效的检测手段，如DNA提取试剂盒和蜡样芽胞杆菌检测PCR试剂盒，标准中对PCR法的包含性和排他性也没有进行全面分析[12]。

3 结语

食品、化妆品等产品微生物检验方法系列标准是推动中国食品、化妆品等产品质量、安全发展的重要方法和检验依据，同时也是我国食品、化妆品等国家安全标准及行业标准体系建设的重要组成部分。蜡样芽胞杆菌是目前引起食源性疾病暴发的主要致病菌之一，作为一种条件致病菌，其致病性主要是由两个因素决定：①该菌是否携带毒力基因并能正确表达；②在被污染的食品样品中，蜡样芽胞杆菌的水平是否可达到105 CFU·g-1或更高水平。所以对蜡样芽胞杆菌的检验也应围绕这两个条件展开。随着国际标准先进理念的不断更新，检验检测技术的不断智能化、快速化，我国也应加强国际食品贸易和国内监管体系的科学性和有效性，促使我国食品安全微生物检验水平和效率更符合经济发展的需要，加快推进我国食品安全国家标准及行业标准体系建设。

参考文献

[1]ALVITO P，BRAZÃO R，CARMONA P，et al.Risk Benefit 4 EU–partnering to strengthen risk-benefit assessment within the EU using a holistic approach of EFSA[EB/OL].[2019-12-11]（2024-06-10）.https：//efsa.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.2903/sp.efsa.2019.EN-1768.

[2]闫韶飞，闫旭，甘辛，等.我国市售婴儿配方乳粉中蜡样芽胞杆菌污染及其毒力基因调查[J].中国食品卫生杂志，2015，27（3）：286-291.

[3]赵薇，杨修军，张思文，等.2011—2019年吉林省食品中蜡样芽胞杆菌污染状况分析[J].中国食品卫生杂志，2020，32（6）：660-663.

[4]ISO.Microbiology of food and animal feeding stuffs—horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus—colony-count technique at 30 degrees C：ISO 7932：2004/Amd 1：2020[S/OL].[2020-03-01]（2024-06-10）.https：//www.iso.org/standard/76664.html.

[5]EFSA Panel on Biological Hazards （BIOHAZ）.Risks for public health related to the presence of Bacillus cereus and other Bacillus spp. including Bacillus thuringiensis in foodstuffs[J].EFSA Journal，2016，14（7）：e04524.

[6]GUINEBRETIERE M H，VELGE P，COUVERT O，et al.Ability of Bacillus cereus group strains to cause food poisoning varies according to phylogenetic affiliation （groups Ⅰ to Ⅶ） rather than species affiliation[J].Journal of Clinical Microbiology，2010，48（9）：3388-3391.

[7]FAGERLUND A，WEEN O，LUND T，et al.Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus[J].Microbiology （Reading），2004，150（Pt 8）：2689-2697.

[8]FDA.BAM Chapter 14： Bacillus cereus[EB/OL].（2021-06-29）[2024-05-20].https：//www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-14-bacillus-cereus.

[9]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验：GB 4789.14—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[10]中华人民共和国国家进出口商品检验局.出口食品中蜡样芽胞杆菌检验方法：SN/T 0176—2013[S].北京：中国标准出版社，2013.

[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.出口食品中蜡样芽胞杆菌快速检测方法 实时荧光定量PCR法：SN/T 3932—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[12]国家食品药品监督管理总局科技和标准司.微生物检验方法食品安全国家标准实操指南[M].北京：中国医药科技出版社，2017.