枇杷中产乙醇酵母的分离鉴定与生物学特性研究

◎ 佀胜利，吴超群，申 娜，彭明引

（凯里学院大健康学院，贵州 凯里 556011）

关键字：产乙醇酵母；分离鉴定；生物学特性；枇杷果实

枇杷是亚热带特色水果，果肉酸甜多汁，含有大量的碳水化合物、维生素及多种矿物质[1]。由于出果期短，枇杷鲜果难以长期保存[2]。枇杷酒是以枇杷为原料，采用酵母菌发酵而成的一种低度饮料酒[3-4]。其中，酵母的种类对枇杷酒的口感、香气和质量都会产生一定的影响[5]。因此，本研究从枇杷果实中分离筛选乙醇产量高的酵母菌，并进行生物学特性研究，旨在为选育用于枇杷酒酿造的专用酵母提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

枇杷产地为贵州省凯里市。

YPD 培养基：酵母膏10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1，115 ℃灭菌30 min；制备固体培养基再加入20 g·L-1琼脂。红四氮唑（TTC）上层培养基：葡萄糖5 g·L-1，琼脂15 g·L-1，121 ℃灭菌20 min。TTC 配成浓度为0.05 g·mL-1的母液，过滤除菌后避光低温保存。使用时，待溶解的葡萄糖琼脂培养基温度降至40～50 ℃时，向培养基中加入1%TTC 母液，混合均匀后制成TTC 上层培养基。

1.2 仪器与设备

立式高压蒸汽灭菌器（LDZF-75L，上海申安）；洁净工作台（SW-CJ-1FD，苏州安泰）；霉菌培养箱（MJ-150-I，上海一恒）；液相色谱（LC20，岛津）。

1.3 方法

1.3.1 产乙醇酵母的分离与纯化

将新鲜采集的枇杷果实带回实验室后，用纯净水冲洗果实表面，破碎后称取5 g，加入装有45 mL 无菌水的三角瓶中，28 ℃下150 r·min-1振荡培养24 h，得到天然酵母菌悬液。将菌悬液依次稀释至10-7，取稀释度为10-5、10-6、10-7的稀释液200 μL 均匀涂布于YPD 平板上，28 ℃静置培养24 h。挑选与酵母菌菌落形态相似的单菌落，以平板划线的方式接种在新的YPD 平板上，纯化后编号菌株，并保存备用。

1.3.2 产乙醇酵母的筛选

（1）初筛。在YPD 平板上培养菌株1～2 d，待长出明显的菌落，将融化并配制好的TTC 上层培养基缓慢倾倒其上，避光培养3 h，选取菌落颜色为深红色的菌株进行后续试验。

（2）复筛。将初筛得到的菌株制作菌悬液，按5%接种量接种到装有杜氏小管的YPD 液体培养基中，28 ℃静置发酵48 h，每隔4 h 加以观察，并记录杜氏小管的充气情况。发酵结束后，取一定体积的发酵液，用液相色谱测定发酵液中残留葡萄糖浓度和发酵产生的乙醇浓度。

1.3.3 产乙醇酵母的分子生物学鉴定

将复筛得到的酵母菌株送往上海生物工程公司进行26S rDNA D1/D2 区域序列纯化扩增和测序，将得到的测序结果与GenBank 数据库中已知序列进行同源比对，找出与其相似性较高的菌株及代表菌株，构建系统发育树图谱，确定菌株的分类地位。

1.3.4 产乙醇酵母的生物学特性试验

（1）种子培养液的制备。将复筛得到的菌株接种在YPD 液体培养基中，28 ℃下150 r·min-1振荡培养24 h，将菌液的酵母细胞数调整到105·mL-1，制得种子培养液。

（2）温度对酵母菌株发酵产乙醇的影响。按照5%的接种量，将种子培养基分别接种至含有杜氏小管的YPD 液体培养基中，在23、28、33、38 ℃温度下静置培养48 h，每隔4 h 观察杜氏小管的充气情况。每个温度下接种3 个平行。

（3）初始pH 对酵母菌株发酵产乙醇的影响。按照5%的接种量，将种子培养基分别接种至初始pH 为4.0、6.0、8.0、10.0 的含有杜氏小管的YPD 液体培养基中，在各菌株的最适生长温度下静置培养48 h，每隔4 h 观察杜氏小管的充气情况。每个pH 下接种3 个平行。

1.3.5 发酵液中葡萄糖和乙醇浓度测定方法

采用液相色谱法分析发酵液中的物质浓度，色谱柱为Shedox Sugar SH1011，流动相为5 mmol·L-1的硫酸溶液，洗脱方式为等梯度洗脱，流动相流速为0.8 mL·min-1，进样量为10 μL，柱温为60 ℃，检测器为示差折光检测器。

2 结果与讨论

2.1 产乙醇酵母的分离纯化与筛选

经过富集培养和稀释涂布，从枇杷果实中分离纯化得到类似酵母菌的菌株30 株，编号为LY1-LY30。对30 株酵母菌进行TTC 显色反应，LY3、LY5、LY13、LY15、LY18 共5 株酵母菌株呈红色，其余无明显变化。将这5 株菌株进行静置发酵，定期观察杜氏小管产气情况，结果如表1 所示。由表1 可知，LY3、LY5、LY15 起酵较快；16 h 内，杜氏小管充满气体，LY13 和LY18 产气较慢。

表1 天然酵母菌株发酵杜氏小管满气所需时间表

静置发酵48 h 后，测定发酵液中的乙醇和葡萄糖浓度，结果如图1 所示，LY3、LY5、LY15 的乙醇浓度较高且均超过5 g·L-1。同时，以上菌株发酵液中残留葡萄糖较少，均低于0.01 g·L-1。因此，结合发酵产气情况，将LY3、LY5 和LY15 共3 个菌株作后续研究。

图1 酵母菌发酵液中葡萄糖浓度（A）和乙醇浓度图（B）

2.2 产乙醇酵母的分子生物学鉴定

对产乙醇酵母的26S rDNA D1/D2 区序列在Gene Bank 数据库中进行同源比对，LY3 与葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）的相似度较高，在99.66%～100%之间；LY5 和LY15 与罕见有孢汉逊酵母（H.occidentalis）的相似度较高，在99.31%～100%之间。对3 株酵母菌株与有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）中代表种的模式菌株进行序列比对和系统发育树构建，如图2 所示。LY3 与葡萄汁有孢汉逊酵母（H.uvarum）关系较近，可以认为是同一个种；LY5、LY15 与罕见有孢汉逊酵母（H.occidentalis）关系较近，可以认为是同一个种。

图2 产乙醇酵母菌株的26S rDNA 系统发育树图

2.3 产乙醇酵母的生物学特性

2.3.1 不同温度下酵母发酵产乙醇情况

观察酵母发酵过程中杜氏小管的充气情况，以研究温度对酵母发酵产乙醇的影响，结果如图3 所示。其中，3 株菌株杜氏小管充满最快的发酵温度都是28 ℃；LY3在33 ℃和38 ℃下杜氏小管没有充气，LY5 和LY15 在38 ℃时杜氏小管没有充气，说明相应温度下没有CO2和乙醇的生成，LY5 和LY15 产乙醇性能对温度的耐受性更强；LY5 在33 ℃时，杜氏小管充满气体的时间比23 ℃时早8 h，说明LY5 在33 ℃的条件下，发酵乙醇的速度更快，即对温度胁迫的耐受性最强。

图3 温度对酵母菌株LY3（A）、LY5（B）、LY15（C）发酵产气的影响图

2.3.2 不同初始pH 条件下酵母发酵产乙醇情况

观察不同pH 下各产乙醇酵母发酵过程中杜氏小管的充气情况，研究初始pH对酵母发酵产乙醇的影响，结果如图4 所示。LY3 在初始pH 6.0 时产气速度最快，LY5 和LY15 在初始pH 4.0 时最快，说明pH 条件对酵母菌发酵产乙醇的影响具有菌株个体差异性。随着碱性条件的增强，4 个菌株发酵产乙醇速度都呈现一定的延滞；初始pH 为10.0 时，LY3 的产气延滞期最短，说明LY3 对pH 的耐受性较好。

图4 初始pH 对酵母菌株LY3（A）、LY5（B）、LY15（C）发酵产气的影响图

3 结语

本研究从枇杷果实中分离得到30 株菌落形态类似酵母菌的菌株，通过TTC 显色反应初筛和液体发酵产物测定结合产气能力评价复筛，得到3 株发酵产乙醇能力较强的酵母菌株。经分子生物学鉴定，LY3 为葡萄汁有孢汉逊酵母，LY5、LY15 为罕见有孢汉逊酵母；温度对各菌株发酵产乙醇性能的影响表明，LY5对温度的耐受性较好；初始pH 对各菌株发酵产乙醇性能的影响表明，LY3 对初始pH 的耐受性较好。