柯萨奇病毒A 组16 型抗原ELISA 定量检测方法的建立与初步应用

张浩然 姜莉 刘鹏 田华平 刘碧云 徐华 曹明翔 杨二霞

（艾美行动生物制药有限公司 江苏泰州 225300）

0 引言

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是全球性传染病，已在全世界范围内暴发或流行[1]。我国自2008 年将其列入丙类传染病[2-3]，2008—2019 年全国法定传染病疫情概况显示我国报告的HFMD 约2 248万例，平均年发病率为152/10 万，报告重症病例约16 万例，死亡超过3 600 人[4]。 柯萨奇病毒A 组16型（Coxsackievirus A16，CA16） 是引起HFMD 的主要病原体。CA16 与肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）所致的HFMD 在临床上难区别， 但CA16 分布范围广，导致发病人数多，常占HFMD 发病率的60%以上[5-6]，而且在近年也发生了CA16 感染导致重症的病例甚至引发死亡，例如致死性心肌炎、肺水肿等[7-9]。因此， 在已有EV71 疫苗上市的情况下， 研发针对CA16 的疫苗对预防HFMD 具有重大意义。在CA16疫苗产品工艺开发过程中，CA16 抗原含量是疫苗质量控制的关键指数。 本实验建立了CA16 抗原双抗体夹心定量ELISA 检测方法，为此过程提供了检测方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AKTA pure 150 型蛋白纯化仪 （美国GE 公司）；ST-36W 型全自动洗板机（上海科华公司）；JCSY 型水浴锅（上海一恒公司）；Multiskan 1510 型全波长酶标仪（美国Thermo 公司）。

1.2 材料

Vero 细胞和KMB17 细胞 （中国医学科学院医学生物学研究所）；清洁级新西兰兔（雌性，体重3 kg，动物合格证号：SCXK（苏）2017-0001，南京青龙山动物繁殖场）；CA16 抗原国家标准品（批号201507001，标示量2 000 U/mL，蛋白浓度2 μg/mL，中国药品食品检定研究院）；BCA 蛋白定量试剂盒（北京康为世纪公司）；Protein G 亲和层析柱（上海博格隆公司）；单组分TMB 显色液（北京索莱宝公司）；超滤浓缩管（100KD，美国Pall 公司）；CA16 收获液（批号202103）、CA16 超滤浓缩液（批号202103）、CA16 纯化灭活液（批号202103）、CA16 原液（批号202103，2 000 U/ml）、EV71 原液（批号20210101，5 065 U/ml）、HAV 原液（批号20210303，6 400 EU/ml）、H1N1 流感病毒（批号20191009， 滴度5.25 log 每毫升细胞培养半数感染量）均来自艾美康淮生物制药（江苏）有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清白蛋白、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）均购自美国Sigma 公司。

2 方法

2.1 CA16-IgG 多克隆抗体（多抗）的制备

2.1.1 动物免疫

初免将CA16 纯化病毒液与弗氏完全佐剂等体积充分混合成乳膏状，经腋窝、背部、腹股沟皮下多点免疫新西兰兔，接种抗原剂量为4 000 U/只，每点注射0.2 mL。 初免后4 周以相同剂量与方法使用弗氏不完全佐剂加强免疫1 次。

2.1.2 血清分离与检测

兔耳缘静脉采血，分离血清，采用血清中和法监测其抗体效价。 当抗体效价较高时取兔全血，分离血清。

2.1.3 多抗纯化

按照Protein G 亲和层析产品说明书纯化免疫血清，获得多抗，将CA16-IgG 纯化液经100 KD 超滤浓缩管超滤浓缩，利用BCA 蛋白定量法测定其蛋白含量。

2.2 纯化CA16 多抗的评价

2.2.1 纯度分析

配制10%分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后分析抗体纯度。

2.2.2 纯化抗体效价检测

采用ELISA 竞争法， 将抗体进行倍比系列稀释，10 μL/孔，加入HRP 标记的纯化多抗，90 μL/孔，混合后37℃孵育3 h，洗板后四甲基联苯胺显色，检测波长450 nm，参比波长630 nm，于酶标仪上读取吸光度值（A450/630nm）。 cut off 值为（阴性平均值-阳性平均值）/2。

2.3 酶标抗体的制备

采用高碘酸钠法将HRP 醛化后与纯化CA16多抗结合，使用乙二醇终止反应，使用硼氢化钠封闭多余醛基，使其还原成稳定态，利用硫酸铵沉淀后透析获得酶标抗体。

2.4 双抗体夹心ELISA 的建立

将CA16 多抗与酶标抗体进行系列稀释， 采用棋盘法确定两者最佳工作浓度，并对包被条件、封闭条件、样品稀释液、酶稀释液以及反应时间、孵育条件等进行优化，建立检测体系。

采用碳酸盐缓冲液将CA16 多抗浓缩液稀释到2.0 μg/mL，包被至96 孔酶标板上，100 μL/孔，置4℃12 h，洗板3 次，加入1.5% BSA 封闭液，置4℃12 h，洗板3 次，晾干后于箒20℃保存。

使用时将板室温平衡30 min， 加样100 μL/孔，用0.01 mol/L PBS 在板内进行对倍稀释， 设三孔阴性对照，两孔空白对照，37℃孵育2 h，洗板机洗板5次，1 min/次，300 μL/孔，拍干，加入HRP 标记的CA16多抗，100 μL/孔，37℃孵育1 h。 此CA16-IgG-HRP用酶稀释液（0.01 mol/L PBS 配制的1.5%BSA）稀释使用，经条件试验检测，稀释比例确定为1∶9 000。 洗板机洗板5 次，1 min/次，300 μL/孔，拍干，加入TMB单组分显色液，100 μL/孔，37℃孵育10 min，加入2 mol/L硫酸终止反应，50 μL/孔，10 分钟内用酶标仪读取结果，以A450/630nm作为检测结果。

2.5 方法验证

按照《中国药典》三部（2020 版）中《生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则》[10]的要求，对检测方法进行验证，对本试剂盒的线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性、专属性进行验证。

2.5.1 线性和最低检测下限

用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）将CA16 抗原国家标准品（2μg/mL）分别稀释至90.91、45.45、22.73、11.36、5.68、2.84、1.42、0.71 ng/mL。 用建立的方法对各样品进行检测，双复孔上样，以不同浓度样品的A450/630nm和抗原含量进行线性拟合， 根据拟合直线的斜率及决定系数分析最佳线性范围，并确定最低检测下限。

2.5.2 精密度

2.5.2.1 日内精密度

使用该体系由3 位实验员于同一时间分别独立操作， 将CA16 国家标准品用0.01 mol/L PBS（pH 7.4）稀释至45.45 ng/mL（A450nm＞1.0，代表强阳性）、11.36 ng/mL（A450nm=0.4～0.7，代表中阳性）、2.84 ng/mL（A450nm=0.1～0.25，代表弱阳性），用建立的方法进行测定， 计算不同浓度样品在不同操作人员间的变异系数（CV），即变异系数=标准差÷平均值×100%。

2.5.2.2 日间精密度

由3 位实验员于3 个不同时间点使用该检测体系分别独立操作，按2.5.2.1 方法稀释CA16 国家标准品，用建立的方法进行测定，计算CV。

2.5.3 准确度验证

按2.5.2.1 方法稀释CA16 国家标准品，用建立的方法进行检测， 计算实际测定值并根据理论值计算相对偏倚（RB），分析该方法的准确度。

2.5.4 特异性验证

用该方法检测流感病毒收获液、EV71 收获液、HAV 收获液，vero 细胞和KMB17 细胞裂解液等样品，分析该方法的特异性。

2.5.5 稳定性验证

将CA16 抗体包被板放于含干燥剂的铝箔袋中抽真空后置于37℃温箱，放置5 d 后测定，以-20℃保存的CA16 抗原包被板做对照，比较该保存条件下的线性、最低检测下限、特异性、精密度以分析其稳定性。

2.5.6 适用性分析

对3 批CA16 收获液、超滤浓缩液、纯化灭活液与原液进行抗原检测， 以监测CA16 抗原制备过程中的比活。

3 结果

3.1 兔抗CA16 多抗的制备及鉴定

利用血清中和的方法检测免疫前及免疫过程中的兔血清CA16 抗体效价，初免后28 d 内抗体效价相对较低， 初免28 d 进行二免后效价迅速升高，抗体效价最高达1∶20 480， 但在二免14 d 发现其有下降趋势，随即采集兔全血，分离较高效价兔血清。 利用SDS-PAGE 电泳及银染的方法检测CA16 多抗纯度，结果出现50 000 和23 000 这2 条带，无其他杂带（图1）；使用超滤管对CA16-IgG 纯化液进行超滤浓缩，BCA 蛋白定量的方法测定CA16 多抗蛋白浓度为23.8 mg/mL。

图1 纯化的柯萨奇病毒A 组16 型多抗电泳图Fig.1 Electrophoretic map of purified Coxsackie virus group A type 16 polyclonal antibody

3.2 性能验证

3.2.1 线性和最低检测下限

采用建立的方法， 吸光度值与蛋白浓度拟合曲线作回归分析方程， 重复检测发现线性范围在0.71～45.45 ng/mL 之间， 与其吸光度值呈良好的线性关系，R2＞0.997（图2）；以阴性平均值的2.1 倍作为判定结果，其最低检测下限为2.84 ng/mL。

图2 柯萨奇病毒A 组16 型国家标准品的标准曲线Fig.2 Standard curve of national standard for Coxsackie virus group A type 16

3.2.2 精密度

计算日内精密度，高、中、低3 个浓度样品变异系数分别为3.86%、5.29%、7.83%， 均小于15%（见表1）。

表1 柯萨奇病毒A 型16 抗原ELISA 定量检测方法 （x±s）Table 1 Intraday Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

表1 柯萨奇病毒A 型16 抗原ELISA 定量检测方法 （x±s）Table 1 Intraday Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

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计算日间精密度CV 值，在高、中、低3 个浓度样品变异系数分别为6.59%、12.55%、14.83%， 其变异系数有所上升，但同样小于15%。 表明该方法具有良好的精密度（见表2）。

表2 柯萨奇病毒A 组16 型抗原ELISA 定量检测方法的日间精度（）Table 2 Daytime Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

表2 柯萨奇病毒A 组16 型抗原ELISA 定量检测方法的日间精度（）Table 2 Daytime Precision of ELISA Quantitative Detection Method for Coxsackie Virus Group A Type 16 Antigen （）

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3.2.3 准确度

如表3 所示，高、中、低3 个浓度样本的相对偏倚（RB）均不高于±12%，表明该方法准确度良好。

3.2.4 特异性试验结果

用该方法检测流感病毒收获液、EV71 收获液、HAV 收获液，vero 细胞对照和KMB17 细胞等样品，结果除CA16 收获液为阳性（A450nm大于cut off 值0.105）外，其余均为阴性，A450nm均小于0.105，表明该方法特异性良好（图3）。

图3 柯萨奇病毒A 组16 型抗原ELISA 定量检测方法的特异性Fig.3 The specificity of the ELISA quantitative detection method for Coxsackie virus group A type 16 antigen

3.2.5 稳定性

稳定性考察结果显示决定系数为0.998； 最低检测下限有一个稀释度的浮动；特异性方面几种非CA16 的样品均为阴性；精密度检测方面高、中、低3个浓度样品日内精密度均小于15%。 证明该方法具有良好的稳定性（见表4）。

表4 稳定性试验结果Table 4 Stability Test Results

3.2.6 适用性结果

对CA16 灭活疫苗制备中的中间产物进行抗原浓度的检测，监测3 批CA16 抗原制备过程的比活，结果如图4 所示，比活持续上升，符合生产过程中比活持续升高的规律。利用该方法可指导工艺的探索，为CA16 疫苗研发奠定基础。

图4 CA16 灭活疫苗中间品的比活检测结果Fig.4 Specific Activity Test Results of Intermediate Products of CA16 Inactivated Vaccine

4 讨论

CA16 病毒与EV71 病毒是HFMD 的主要病原体[11]。 现在已有EV71 型HFMD 疫苗上市，而CA16型HFMD 疫苗均处于研发阶段[12]。在研发过程中，亟需一种特异性良好、灵敏度高、精密度、准确度及稳定性良好的检测体系。用该方法建立的体系，较好的达到了上述要求。在CA16 疫苗研发过程中，用该方法检测中间产物，用反馈回来的数据，改进工艺，为CA16 疫苗的研发奠定了基础。

在建立方法时发现抗血清效价受新西兰兔个体差异影响较大。随着免疫次数的增加，抗体效价先升后降，在二免10 天左右达到峰值后，提示需实时监测兔抗血清效价水平，取其峰值进行血清收集。

该方法在线性范围0.71～45.45 ng/mL，决定系数＞0.997，即在这个范围内形成的复合物和检测抗原含量成较好的正比关系，且最低检测下限为2.84 ng/mL，体现了较高的灵敏度。综上所述，该体系建立的方法具有较高的灵敏度、精密度和稳定性。该方法能够较好的满足CA16 疫苗的研发工作， 为未来产业化发展奠定基础。