实验室细菌内毒素定量检测方法建立与验证

李辉 汤曼莉 杨玉玲 吴愫青

（珠海市食品药品检验所 广东珠海 519000）

0 引言

细菌内毒素是注射剂中的主要致热物质[1]，自20世纪60 年代阐明并建立鲎试验方法学以来[2]，细菌内毒素检查法具有操作简单快速、灵敏度高、准确度高的优点[3]，因此可作为热原检查法的有效补充[4]，以控制药品质量，提高药品国家标准[5]。

本实验采用内毒素检测中的动态浊度法， 选取常见检品维生素注射液和氯化钠注射液， 对照3 种不同厂家的鲎试剂进行动态浊度法测定细菌内毒素结果， 验证不同厂家的鲎试剂对细菌内毒素定量检测的灵敏度和准确性。

1 实验材料

1.1 仪器

TAL-96G 型试管恒温仪（湛江安度斯生物有限公司）；MS3 基本型震荡器 （德国IKA 集团公司）；DHG9077A 型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；试管、试管架、微量移液器及配套无热原枪头等。

1.2 药品与试剂

维生素C 注射液（国药集团容生制药有限公司，规格：2 mL∶0.5 g，批号：1911301）；氯化钠注射液（江西科伦药业有限公司， 规格：250 mL∶2.25 g， 批号：C20033301B）；氯化钠注射液（广东艾希德药业有限公司，规格：250 mL∶2.25 g，批号：191209101）；鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，0.01 EU/mL， 批号：1809270； 厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，0.01 EU/mL，批号：21034103；福州新北生化工业有限公司，0.01 EU/mL，批号：23051212）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院生产，规格80 EU/支，批号：150601-201886）； 细菌内毒素检测用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批号：2008120）。

2 方法与结果

2.1 供试品细菌内毒素限值（L）的确定

依据《中国药典》（2020 年版） 二部中维生素C注射液细菌内毒素项规定每1 mg 维生素C 中含内毒素的量应小于0.020 EU；氯化钠注射液细菌内毒素项规定每1 mL 中含内毒素的量应小于0.50 EU。本次实验采用该标准。

2.2 最大有效稀释倍数（MVD）的计算

参照药典规定的公式：MVD=c·L/λ，计算检品1维生素C 注射液（批号：1911301）MVD 为500 倍；检品2 氯化钠注射液（批号：C20033301B）MVD 为50倍；检品2 氯化钠注射液（批号：191209101）MVD 为50倍。

2.3 动态浊度法定量检测方法验证

2.3.1 线性关系

本试验采取最严格要求，制备了0.01、0.05、0.1、0.5、1 EU/mL 等5 个细菌内毒素标准品浓度，每个浓度平行3 管，阴性对照2 管，进行标准曲线可靠性试验。所得标准曲线回归方程：LgTg=2.586 1-0.365 6 LgC，r=-0.994 7，|r|＞0.980，表明本实验动态浊度法定量检测线性良好。

2.3.2 适用性

本实验的适用性考察包括预干扰实验和专属性实验。 预干扰实验考察样品对内毒素定量检测的影响， 专属实验考察所采用的分析方法能否正确测定出被测物（细菌内毒素）的能力。

2.3.2.1 预干扰实验

本实验采用湛江安度斯鲎试剂、 厦门鲎试剂和福州新北鲎试剂考察不同稀释倍数样品的内毒素的回收率（表1）。

表1 不同倍数稀释样品在3 种鲎试剂条件下的预干扰实验结果Table 1 The pre-interference test results of different dilution samples under the condition of three limulus reagents

由表1 可知， 湛江安度斯鲎试剂和福州新北鲎试剂条件下， 不同稀释级别样品回收率均在50%～200%内，样品不存在干扰，高稀释级别比低稀释级别回收率高。 厦门鲎试剂的预干扰实验结果比其他2种鲎试剂在同样实验条件下检测的回收率结果低，2倍稀释氯化钠溶液细菌内毒素回收率低于50%，低稀释倍数的样品溶液对实验存在干扰。 试验结果显示， 厦门鲎试剂与其他2 种鲎试剂质量参数存在差异，抗干扰能力较差。 因此，本次实验采用回收率较高的高稀释级别样品溶液进行正式干扰实验测定。

2.3.2.2 专属性实验

本实验采用氯化钠注射液（批号：191209101）进行专属性实验， 参照预干扰实验结果， 标准曲线取0.01、0.1、1 EU/mL 等3 个细菌内毒素标准品浓度，制备含0.1、0.5、1 EU/mL 细菌内毒素50 倍稀释供试品溶液， 测定回收率分别为100.79%、78.27%、64.17%，回收率均在50%～200%之间，符合要求，实验方法专属性良好。

2.3.3 重复性

在规定范围内，取同一浓度的供试品，用至少6份的测定结果进行评价。 氯化钠注射液内毒素限值为0.5 EU/mL， 参照适用性实验最优结果， 配制含0.5 EU/mL 细菌内毒素的50 倍供试液稀释液，以0.01、0.1、1 EU/mL 3 个细菌内毒素标准品浓度为标准曲线，进行6 次平行测试，计算回收率及RSD 值。参照药典对重复性的要求，本次实验所使用的试剂氯化钠注射液浓度为0.9%， 稀释50 倍浓度为0.018%，重复性RSD 值为2.54%，小于3%，本次实验重复性良好，符合规定。

2.4 标准曲线可靠性试验

本实验通过标准曲线可靠性试验求得湛江安度斯鲎试剂标准曲线回归方程：LgTg=2.662 1-0.336 1 LgC，r=-0.999 3；厦门鲎试剂的标准曲线回归方程：LgTg=2.568 1-0.373 1LgC，r=-0.998 2； 福州新北鲎试剂标准曲线回归方程：LgTg=2.716 2-0.300 6LgC，r=-0.999 8。 3 个厂家鲎试剂标准曲线回归方程|r|均大于0.998 0，平行管RSD 均小于10%，故所得标准曲线有效。

2.5 干扰实验

本实验根据预实验结果采用最高稀释倍数样品进行干扰试验，实验结果见表2、表3 和表4。

表2 湛江安度斯鲎试剂的干扰试验结果Table 2 interference test results of Zhanjiang Andus Limulus agent

表3 厦门鲎试剂的干扰试验结果Table 3 Interference test results of Xiamen Limulus agent

表4 福州新北鲎试剂的干扰试验结果Table 4 interference test results of Fuzhou xinbei Limulus agent

结果显示，3 批检品在湛江鲎试剂、厦门鲎试剂和福州新北鲎试剂条件下均未检测到细菌内毒素，结果一致。样品阳性对照回收率均在规定范围内，但厦门鲎试剂条件检测下的回收率均比湛江鲎试剂和福州新北鲎试剂的低，与预干扰实验结果相符。

3 讨论

本实验是我所开展的细菌内毒素动态浊度法检测能力扩项实验， 通过对动态浊度法方法的验证，建立了实验室定量检测细菌内毒素方法，同时选取了检测频率高的检品氯化钠注射液和维生素C注射液作为样品，采用3 个不同厂家的鲎试剂分别进行验证， 验证动态浊度法定量检测的可靠性、灵敏度和准确性。

实验结果表明，氯化钠注射液和维生素C 注射液在最大有效稀释倍数（MVD）相较其他稀释级别回收率更高，本实验均采取最大有效稀释倍数进行样品稀释检测；在厦门鲎试剂条件下，低稀释倍数氯化钠注射液干扰作用明显， 回收率低于50%；供试液在厦门鲎试剂反应条件下比湛江安度斯鲎试剂和福州新北鲎试剂的反应时间短，回收率低。

鲎试剂法检测细菌内毒素含量，会受到很多因素的影响，如供试品的pH 值、温度、离子强度、浓度等[6]，同时，不同厂家生产鲎试剂质量差数会存在一定差异，其抗干扰能力不同[7]。 因此，虽然不同厂家的鲎试剂标示灵敏度相同，但会因实际灵敏度不同导致同一样品产生完全不同的检测结果[8]，故选用新批次鲎试剂时应进行灵敏度复核，并选用标示灵敏度与实际灵敏度相符的鲎试剂进行检验，以保证实验结果的准确性。

本实验建立的细菌内毒素动态浊度法可以满足日常定量检测检品细菌内毒素的需求，不受鲎试剂种类的影响，结果灵敏、准确。 同时，该方法具备可追溯性[9]，出现假阳性结果时，应用动态浊度法判断实验结果的条件更全面，更利于分析原因[10]。