基于衍生化UPLC法测定不同产地天麻中19种游离氨基酸含量*

严春荣，魏建强，张海瑞，黄子玉，孙梦凡，刘祥义，侯 英**

(1.玉溪市质量技术监督综合检测中心，云南 玉溪 653100；2.云南华衡检测技术有限公司，云南 昆明 650106；3.西南林业大学，云南 昆明 650224)

天麻(Gastrodia elata Blume)是名贵中药材之一，隶属兰科天麻属多年寄生草本植物，以干燥块茎入药，作为药膳，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通路等药理功效及保健、营养和食用价值[1]。现代药理学研究表明，天麻具有脑保护、镇痛、抗癫痫、抗晕眩、降压、降血脂、保肝、增强免疫力等药理活性[2-3]。游离氨基酸作为构成蛋白质分子的基本单位，是构成人体的最基本物质之一，具有调节人体氮平衡，增强免疫力和健体补虚的功效[4-5]。作为药食同源的新食品原料，天麻中的游离氨基酸的含量能反映出天麻的营养价值。目前对天麻中游离氨基酸的相关研究报道相对较少，对其开展分析评价研究，可以为天麻的营养与质量评价及进一步开发利用天麻资源提供理论基础。

采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸含量已有报道[6-8]，但因仪器价格昂贵，所以采用柱前/柱后衍生结合液相色谱分析游离氨基酸含量，特别是柱前衍生化具有时间短、衍生物稳定、灵敏度高、重现性好等优势受到研究者青睐[9]。殷娇阳等[10]采用邻苯二甲醛和9-氯甲酸芴甲酯联用对灵芝孢子粉中的氨基酸进行柱前衍生，然后采用高效液相色谱法测定氨基酸的含量，结果准确、重复性好。杨卫灵等[11]以异硫氰酸苯酯为柱前衍生剂，结合液相色谱法，测定黔产玛咖氨基酸的组成及含量，发现玛咖中氨基酸种类齐全且含量丰富。

本文将天麻中游离氨基酸经6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯衍生化生成具有荧光的衍生物，经超高效液相色谱(UPLC)分离，用保留时间定性，标准曲线法定量，建立天麻游离氨基酸含量的测定方法，并对不同产区天麻中氨基酸含量进行对比分析，可为天麻的品质评价及种植基地选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

U3000高效液相色谱仪(配荧光检测器，美国热电公司)；BSA224S电子天平(感量：0.1 mg，赛多利斯公司)；RD-C18色谱柱(Ф4.6 mm×250 mm，3 μm，中谱红)；KQ-500DE型超声波萃取仪(昆山市超声仪器有限公司)。Ф13 mm×0.45 μm 微滤膜过滤器(天津腾达过滤器件厂)；Milli-Q 纯水仪(美国Millipore公司)；HMS-350涡旋振荡器(天津市恒美科技发展有限公司)；电热恒温干燥箱(旭朗机械设备有限公司)。

乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；衍生化试剂：6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(CAS：148757-94-2，w≥97%，上海源纯生物科技公司)。

19种标准品：γ-氨基丁酸(CAS：56-12-2)、L-丙氨酸(CAS：56-41-7)、L-苯丙氨酸(CAS：63-91-2)、L-蛋氨酸(CAS63-68-3)、L-脯氨酸(CAS：147-85-3)、甘氨酸(CAS：46-40-6)、L-胱氨酸(CAS：56-89-3)、L-谷氨酸(CAS：56-86-0)、L-谷氨酰胺(CAS：56-85-9)、L-精氨酸(CAS：74-79-3)、L-赖氨酸(CAS：56-87-1)、L-酪氨酸(CAS：60-18-4)、L-亮氨酸(CAS：61-90-5)、L-苏氨酸(CAS：72-19-5)、L-丝氨酸(CAS：56-45-1)、L-天冬氨酸(CAS：56-84-8)、L-天冬酰酸(CAS：70-47-3)、L-缬氨酸(CAS：72-18-4)、L-异亮氨酸(CAS：73-32-5)、L-组氨酸(CAS：71-00-1) (质量分数均大于98%，购自上海源纯生物科技公司)。

9个批次天麻样品采自云南、四川、贵州和陕西等地。其中，云南昭通(A1-A3)、云南其他州市(B4-B6)、省外(C7-C9)。样品采集后用自来水洗净块茎部位，再用蒸馏水冲洗3次，隔水蒸透心，60 ℃ 烘箱干燥。粉碎后过60目筛，存放于自封袋中备用。

1.2 溶液的配制

1.2.1 流动相A的配制

准确称取 190.4 g 无水乙酸钠置于烧杯中，加入适量水，超声溶解后，加入 100 mL 质量浓度为 1 mg/mL EDTA(100 mg 溶解至 100 mL 水中)溶液，加入三乙胺 24.0 mL，转入容量瓶中加水定容至 1000 mL，摇匀。用磷酸调节pH至4.95，加入 0.1 g NaN3过滤，使用时量取 100 mL 定溶至 1000 mL，摇匀备用。

1.2.2 衍生化溶液的配制

称取 0.3 g 6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯于 100 mL 乙腈中，涡旋振荡 30 s，55 ℃ 加热 5 min 至6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯全部溶解，配制成 3 mg/mL 的衍生化试剂。

1.2.3 游离氨基酸标准储备液的配制

分别精密称取γ-氨基丁酸 13.16 mg、L-丙氨酸 11.31 mg、L-苯丙氨酸 20.60 mg、L-蛋氨酸 18.89 mg、L-脯氨酸 15.65 mg、甘氨酸 10.4 1mg、L-谷氨酸 18.92 mg、L-谷氨酰胺 18.24 mg、L-精氨酸 21.37 mg、L-赖氨酸 18.87 mg、L-酪氨酸 22.54 mg、L-亮氨酸 16.81 mg、L-苏氨酸 15.17 mg、L-丝氨酸 13.62 mg、L-天冬氨酸 16.84 mg、L-天冬酰胺 16.68 mg、L-缬氨酸 15.03 mg、L-异亮氨酸 14.58 mg、L-组氨酸 20.52 mg 各于 10 mL 容量瓶中，加入适量的 0.1 mol/L 盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀即为标准储备液。

1.2.4 标准工作溶液的配制

分别精密移取 1 mL 的19种游离氨基酸储备液于 25 mL 容量瓶中，加入适量的 0.1 mol/L 盐酸溶液并稀释至刻度，摇匀即得标准工作溶液1；精密移取 8 mL 标准工作溶液1于 10 mL 容量瓶中，加入适量的 0.1 mol/L 盐酸溶液并稀释至刻度，摇匀即得标准工作溶液2；精密移取 5 mL 标准工作溶液2；10 mL 容量瓶中，加入适量的 0.1 mol/L 盐酸溶液并稀释至刻度，摇匀即得标准工作溶液3；精密移取 5 mL 标准工作溶液3，于 10 mL 容量瓶中，加入适量的 0.1 mol/L 盐酸溶液并稀释至刻度，摇匀即得标准工作溶液4；精密移取 5 mL标准工作溶液4，于 10 mL 容量瓶中，加入适量的 0.1 mol/L 盐酸溶液并稀释至刻度，摇匀即得标准工作溶液5；精密移取 5 mL 标准工作溶液5，于 10 mL 容量瓶中，加入适量的 0.1 mol/L 盐酸溶液并稀释至刻度，摇匀即得标准工作溶液6。

1.3 色谱条件

荧光检测器激发波长 250 nm，发射波长 395 nm，PMT增益值为1；柱温 40 ℃。流动相流速为 1 mL/min；进样量为 2 μL；梯度洗脱条件见表1所示。

表1 梯度洗脱程序

1.4 样品测定方法

称取 0.2 g 制备好的样品于 10 mL 具塞离心管中，加入 10 mL 的 0.1 moL/L 的盐酸溶液，超声萃取 30 min，取上层清液过 0.45 μm 滤膜，备用。

移取衍生用缓冲液 70 μL 于洁净的玻璃内插管中，移取样品萃取液或标准工作液 10 μL 迅速涡旋混匀，然后加入衍生化试剂 20 μL，涡旋混匀 10 s，加盖密封于进样瓶中，室温静置 1 min，转移至 55 ℃ 烘箱中，加热 10 min，取出进行HPLC测定。用色谱工作站记录峰面积，采用外标法计算游离氨基酸的含量。每份样品重复检测2次，取平均值为该样品中游离氨基酸的含量。天麻样品中19种游离氨基酸的色谱图见图1，色谱峰分离良好。

图1 天麻样品中19种游离氨基酸测定的色谱图

2 结果与分析

2.1 标准曲线制作

配制一系列不同质量浓度的游离氨基酸混合标准溶液，按1.3色谱条件进样测定。以峰面积(Y)对质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归，计算回归方程和相关系数(见表2)，各组分标准曲线的相关系数在0.9969～0.9997范围，表明19种游离氨基酸在一定质量浓度范围内线性关系良好。通过测定各游离氨基酸信噪比为3∶1时所对应的质量浓度，计算各游离氨基酸的检出限在1.41～75.42 μg/kg 范围。

表2 天麻中游离氨基酸的回归方程、相关系数和检出限

2.2 重现性考察

称取6份混合标准品，按“1.4样品测定方法”进行测定，计算6次测定的相对标准偏差(RSD)在0.32 %～1.67 %之间，能够满足样品分析的精密度要求。

2.3 加标回收率

称取相同的样品6份，其中3份中分别加入一定质量浓度的游离氨基酸混合标准溶液，3份作为对照，按“1.4样品测定方法”进行测定。根据测定结果计算加标回收率在91.99 %～114.59%之间，表明用该方法测定天麻中游离氨基酸具有较高的回收率，适用于天麻中游离氨基酸的定量测定。

2.4 不同产区天麻样品游离氨基酸含量分析

不同产区的天麻样品中游离氨基酸的测定结果见表3。从来自不同产区的天麻样品中检测出7种人体必需游离氨基酸(缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)，10种人体非必需游离氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸)及2种其它游离氨基酸(天冬酰胺和γ-氨基丁酸)。结果表明，天麻中游离氨基酸种类及含量丰富，与其具有滋补功效相符。从测定数据看出，不同产地天麻中的游离氨基酸含量存在一定差异，天麻中19种游离氨基酸总量的平均值为 404.46 mg/100 g，总量范围在362.12～644.95 mg/100 g 之间。19种游离氨基酸中含量较高的是谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等，含量较低的是蛋氨酸、氨基丁酸、组氨酸、亮氨酸和脯氨酸等。

表3 不同地区天麻样品游离氨基酸平均含量测定结果 (n=2，mg/100 g)

从表3看出，天麻中19种游离氨基酸总量平均值是云南昭通天麻(517.41 mg/100 g)>省外天麻(507.68 mg/100 g)>云南省内其他地州(444.56 mg/100 g)。云南昭通天麻中的天冬酰胺、天冬氨酸和精氨酸的含量高于其他产区；而省外天麻中的谷氨酸、酪氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等含量高于云南省各产区，特别是在一个省外天麻样品中测定出蛋氨酸，而其他产区的天麻样品中未检出。

3 结论

本文通过6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯为衍生化试剂，结合HPLC法建立天麻中19种游离氨基酸的测定方法。该方法具有精密度好、重现性高等优点，适宜于天麻中多种游离氨基酸的含量测定。测定结果表明，天麻中游离氨基酸种类及含量丰富，不同产地的天麻中游离氨基酸含量存在一定差异。天麻作为我国重要的药食同源药材，游离氨基酸为其滋补作用的主要成分之一，对其研究有助于为天麻的品质评价及种植基地选择提供科学依据。