PCR 技术在实验动物细菌检测中的应用进展

席晓霞，孙 婧，段天林，田永刚，王 芳，张丽娟，张景科，王德贵

（1.兰州大学实验室与设备管理处医学实验中心，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州）

生命科学领域的教学、科研、检定、安全评价和成果鉴定，几乎都离不开实验动物，实验动物的重要作用无可替代。实验动物的质量直接影响着科学实验的准确性和实验动物从业人员的健康。目前评价实验动物质量的主要评判标准之一是微生物质量控制，定期对实验动物进行微生物质量监测是确保实验动物质量的重要手段。近年来，中国实验动物质量监测结果显示，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌等有阳性结果的发生，对实验动物质量的控制造成困扰[1-8]。

屏障环境实验动物微生物质量检测主要依据GB 14922.2-2011《实验动物微生物学等级及监测》的检验流程进行操作，其主要方法是传统的分离培养、生化鉴定。该方法不仅花费时间长、操作步骤相对繁杂、结果判定受主观人为因素影响较大，对一些难以培养的致病细菌也无法进行检测[9]。此外，实验动物在饲养繁殖过程中容易感染各种易感病原，从而导致疾病的暴发和流行，严重影响经济效益和公共卫生，存在很多的安全隐患。因此，建立一种快速、敏感、经济、易于标准化操作的检测技术并纳入实验动物微生物检测国家标准尤为重要。

随着分子生物学技术的不断发展，对实验动物细菌检测的技术也随之上升到了基因水平，其检测、分类的方式日渐增多，特别是基于PCR 的检测技术，因其敏感度高、快速且简便、特异性较强而被广泛应用于实验动物的细菌检测。鉴于PCR 技术在实验动物细菌学研究中的重要性，本文对PCR 技术在实验动物细菌检测中的应用进展综述如下。

1 普通PCR 技术的应用

1985 年Mullis 发明了聚合酶链式反应技术，通过体外模拟DNA 合成过程，可以对目的基因片段进行指数级扩增，使得在体外进行核酸片段的无限扩增成为可能[10]。1995 年唐浏英等发现用PCR 方法检查血细胞中的抗原可对布氏菌感染做到早期诊断，且该技术具有敏感性高、特异性好、快速等优点[11]。2000 年唐永姣等应用PCR技术对甘肃省阿克赛县和玉门市的鼠疫样品进行检测，均呈现阳性，且有较高特异性[12]。

2 多重PCR 技术的应用

多重PCR 是以普通PCR 为基础，同时加入多对引物，可同时扩增出多个目的基因，从而达到对多种病原菌同时进行检测的目的，具有高灵敏度、高度特异敏感、低成本等优点，既能节省试剂又能缩短检测时间[13-14]。

多重PCR 实现了在同一反应体系对多种病原微生物进行检测或具体类型的鉴别诊断，在临床上具有很高的应用价值。陆红玉等建立了适合三种致病菌快速检测的多重PCR 方法，这三种致病菌分别是沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌以及食蟹猴志贺氏菌。从这三种致病菌混合感染的标本中，检测出不同的病原菌，且细菌检出率高于传统的分离培养方法，说明该方法具有很高的特异性和检测灵敏度，且具有很强的实用性和潜在的发展力[15]。冯杰等针对肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌同时进行了培养法和PCR 法检测。通过比较发现，PCR 法检出率略高于培养法，在检测耗时方面，采用国标推荐的分离培养法，其全程检测时间至少需要3～7 d 时间，而PCR 检测法仅需1 d 时间即可完成[16]。王鹏飞等建立了肺支原体、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的多重PCR 检测方法，该方法对三种菌的检测灵敏度为1～10 pg[17]。祝岩波等建立了肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的多重PCR 检测方法，用该方法检测了76 份感染的实验动物粪便标本，其最低检测灵敏度能达到10 pg[18]。张越华等建立的4 重PCR 方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增，无交叉反应，其检测灵敏度为3～10 ng，该方法也可以从混合感染的病料中特异性地检测出4 种致病菌[19]。

3 实时荧光定量PCR 技术的应用

实时荧光定量PCR 检测技术是利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行定量分析。在PCR 反应过程中，随着反应产物的累积，对应的荧光信号强度也随之增强。通过收集每一个循环的荧光强度变化监测产物量的变化，得到荧光扩增曲线图。

王立鹏等分别用细菌分离培养生化鉴定法和Dole qPCR 法对国内多家机构提供的SPF 级小鼠和大鼠进行检测，后者不仅检岀培养法检测的所有阳性样本，而且阳性检岀率远高于培养法，Dole qPCR 方法直接检测组织样本的敏感度和特异度比传统培养鉴定方法均大大提高[20]。阳成波等建立了一种基于TaqMan 探针的实时定量PCR方法，建立了一种用于快速、高效的定量检测空肠弯曲菌的方法[21]。

4 巢式PCR 技术的应用

巢式PCR 反应技术一般需要两对PCR 引物。第一对引物用于普通PCR 扩增。第二对引物用于结合在第一次PCR 产物的内部，进行二次扩增。该方法的优势是最大程度地降低扩增错误率，使得巢式PCR 保持了较高的特异性。

潘雅君等为了检测实验动物常见肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺巴斯德杆菌和绿脓杆菌，提出一种可更准确、灵敏、快速、简便的多重巢式PCR 方法。根据待检微生物16S rDNA序列的保守区和可变区分别设计通用引物和特异引物，通过两种引物长短差异化创新设计，将模板富集和特异片段扩增两个过程整合为单个反应体系内的一步PCR 反应。结果表明，多重巢式PCR 方法能够在标准株DNA 混合模板中同时扩增出4 条待检测片段，而在阴性对照组中未检测出任何片段。多重巢式PCR 方法在实际检测应用中能够成功检测出细菌感染阳性样本，且未扩增出其他微生物的特异性条带。建立的多重巢式PCR 体系可以同时检测实验动物咽拭子等临床样本中的多种病原菌，与常规多重PCR 方法相比，该方法具有特异性和灵敏度高、操作简便、节省时间等优点[22]。

5 数字PCR 技术及其应用

数字PCR 技术是一种能够进行绝对定量的核酸检测技术，目前应用广泛的是微滴式数字PCR，其工作原理是把DNA 稀释至较低浓度，形成微滴状态，随后开始PCR 扩增，通过计算阳性微滴的数目，依据泊松分布从而计算出样本中的DNA 分子数[23]。相关文献表明，与荧光定量PCR 相比，该技术成本低、灵敏度高、定量不依赖于标准曲线，对反应抑制物的耐受能力也更高，可实现DNA 的绝对定量。数字PCR 对核酸含量较低的样品检测准确率和灵敏度均较高[24-25]。

目前实验动物细菌检测的“金标准”仍然是荧光定量PCR 技术，但依赖于标准曲线的Ct值，而在绘制标准曲线的标准品时缺乏统一的计量标准。然而数字PCR 技术综合了荧光定量PCR 和基因芯片的高通量的高精准性，并且不依赖标准物质定量，实现了单分子DNA 绝对定量，能够对目标基因的浓度进行精准分析，目前已被科研人员大量应用于难培养和高风险的致病菌检测研究中，如沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副猪嗜血杆菌、结核分支枝杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、产志贺毒素大肠杆菌等[26-33]。

6 讨论

PCR 基因扩增技术除了用于食品安全和畜牧业检测，还广泛应用于实验动物细菌学的检测。然而PCR 技术也存在很多影响因素，一方面PCR 技术提高检测灵敏度的同时，对其检测中的错误也有放大作用，实验过程中的随机误差易导致假阳性和假阴性结果的出现；另一方面，处理样本会对实验环境造成污染，电泳的EB 染料会危害人的健康，因此在操作过程中要做好防护，严格按实验室的分区进行实验。对于PCR 检测结果的报告要慎重，必须在有相应严格质控措施（如阴、阳性质控等）的情况下重复测定，方可作出报告。

针对PCR 技术的优缺点，目前建立了许多检测病原菌的新型检测方法，均是将两种或两种以上的方法相结合，如PCR 技术与LAMP、基因芯片等技术结合，取长补短，提高动物病原检测的灵敏性、可重复性，克服了传统培养法操作繁琐、耗时费力、不适用于无法培养的微生物、检测周期较长、对检测人员专业技能要求较高等缺点[34-35]，通过一次操作完成多种病原体的检测，实现灵敏、特异、快速和高效的目的，实现了大批量实验动物病原样本的检测、混合感染样品基质中的多种微生物的有效检测、实验动物检测的标准化，这些新的检测方法必将在未来实验动物病原检测中发挥很好的检测作用。PCR 检测方法在效率和敏感性上均具有较大优势，适合用于实验动物细菌感染的快速诊断和大规模的质量筛查[36-39]。

目前多种多重PCR 系统逐步应用于临床，检测耗时3～10 h，成为当下病原菌快速诊断的主流工具[40-47]。其中在稀有突变样本检测、微量核酸样本检测、表达量差异鉴定等方面，数字PCR表现出的优势非常明显。在基因表达研究、microRNA 研究、基因组拷贝数鉴定、单细胞基因表达、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定等诸多方面具有广阔研究前景[48-49]。

PCR 技术因检测快速、高效、灵敏、特异等优点在实验动物细菌检测方面具有较高的价值，已作为一个较为成熟的技术进行广泛的推广应用，尤其适合于实验动物大规模的质量检测和细菌感染的快速诊断。但目前尚未纳入国家标准，还需要进一步对其方案进行改进、细化、具体化、合理化。相信在不远的将来，PCR 技术将越来越成熟，尽早纳入国家标准，应用于实验动物质量检测等工作。