机体保护多肽157对皮肤烫伤和切割伤的保护作用及安全性评价研究

李招招，杜海琛，2，谢 飞，史佳欣，孟赛男，石格格，3，邱玥媛，王昭维，李 萌，张英起，何 磊

1空军军医大学药学系生物制药学教研室，陕西 西安 710032；2解放军联勤保障部队第九四○医院肿瘤科，甘肃 兰州 730050；3西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069)

人体经过手术、烫伤等创伤后，皮肤会受到一定程度的损伤，而伤口愈合是非常复杂的生理过程[1]。在常见的烫伤和切口伤中，皮肤会失去完整性，出现炎症反应，并伴有各种并发症，使患者的病情恶化。因此，开发一种能促进伤口愈合、同时免受并发症影响的药物，对各种严重伤口的治疗具有重要意义。机体保护多肽157(body protection compound 157，BPC157)是从人胃液中分离纯化的15个氨基酸(Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val)多肽[2]，Mr 1 419。研究表明，BPC157有利于肌腱损伤、骨折和韧带损伤的恢复，并对肝脏[3]、胰腺[3]、肌肉[4]、角膜[5]、心脏[6]和神经[7]组织及器官有显著的保护作用。此外，BPC157对胃、十二指肠、食管、结肠等消化系统黏膜也具有良好的保护作用[8-9]。

前期，我们建立了BPC157的固相合成工艺，并在大鼠胃溃疡模型和皮肤碱烧伤模型中验证了其生物活性[10-11]。同时发现BPC157对动物的中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统功能均未产生明显不良影响[12]。我们进一步完成了BPC157在SD大鼠和比格犬体内的药代动力学、组织分布、代谢和药物排泄以及相关的体外研究[13]。以往的研究奠定了BPC157在皮肤伤口治疗领域中的应用基础，为了扩大其适应证，本研究评估了BPC157对较为常见的烫伤和切割伤的治疗作用，证明了BPC157能够显著促进皮肤烫伤和切割伤的创面愈合，并且具有稳定的用药安全性，为BPC157进入临床应用奠定了坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c雄性小鼠70只，6～8周龄，体质量20～22 g；SPF级SD雄性大鼠50只，约6周龄，体质量180～220 g；所有实验动物由空军军医大学实验动物中心提供。在研究过程中，实验小鼠和大鼠均饲养在温度为(25±2)℃的SPF动物房中，实验结束后，对动物实施二氧化碳安乐死。本研究通过了空军军医大学实验动物福利与伦理委员会批准(许可证号：20220505)。

1.1.2 药物与试剂 BPC157由空军军医大学生物制药学教研室合成，经高效液相色谱检测纯度大于99%。重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(贝复新)购自珠海亿胜生物制药有限公司。羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。所有ELISA检测试剂盒(小鼠和大鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白)均购自江苏雨桐生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模 小鼠烫伤模型和大鼠切口伤模型实验均设模型组、阳性对照组(外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶300 IU/cm2)、BPC157剂量组(10、20、40 μg/kg)，每组10只。小鼠在本实验室动物房中饲养1周后，开始构建皮肤烫伤模型。各组小鼠背部脱毛(2 cm×2 cm)，经异氟烷吸入麻醉后，在脱毛处用台式超级恒温烫伤仪接触8 s，造成面积为2 cm2的Ⅲ度烫伤。大鼠在本实验室动物房中饲养1周后，开始构建皮肤切口损伤模型。大鼠背部脱毛，用3 g/L戊巴比妥钠溶液按1 mL/100 g剂量腹腔麻醉后，用无菌手术刀平行于脊柱方向划一个4 cm长的皮肤切口，构建皮肤切口损伤模型。

1.2.2 给药方式 小鼠烫伤模型在造模后当天，BPC157给药组通过皮下注射不同剂量BPC157，给药剂量为0.1 mL/20 g体质量，1次/d，连续给药7 d；阳性对照组于创面外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，剂量300 IU/cm2，1次/d，连续给药7 d；模型组皮下注射生理盐水，0.1 mL/20 g体质量，1次/d，连续给药7 d。

皮肤切口损伤模型建立后，大鼠肌肉注射不同剂量BPC157药物，给药剂量为0.5 mL/200 g体质量；阳性对照组大鼠在创伤表面局部使用剂量为300 IU/cm2的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶；模型组按照0.5 mL/200 g体质量的剂量，肌肉注射甘露醇。各组均每日给药1次，连续给药7 d。

1.2.3 伤口测量 在小鼠烫伤模型中，观察小鼠皮肤烫伤后1、3、5、7 d创面面积，在大鼠切口伤模型中，用透明膜标记测量法观察大鼠皮肤切口损伤后1、3、5、7 d创面面积，计算受试药物组的创面愈合速度。愈合率(%)=[(初面积-终面积)/初面积]×100。

1.2.4 ELISA法检测胶原蛋白含量 采用ELISA法检测实验动物肉芽组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的水平。在皮肤伤口治疗实验结束时，处死动物。收集各组的肉芽组织，用0.15 mol/L的氯化钠洗涤去除血液，制备肉芽组织匀浆进行胶原分析。从每组动物中分离出肉芽组织匀浆，测量Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的水平。密封膜后，加入样品并在37 ℃下孵育60 min。用洗涤溶液洗涤5次后，将板与50 μL链霉亲和素-HRP在室温下孵育1 h。然后向每个孔中加入50 μL染色原溶液A和50 μL染色原溶液B。将溶液轻轻混合并在37 ℃远离光线的地方孵育10 min。最后向每个孔中加入50 μL停止溶液以淬灭反应，测定A450 nm值，根据标准曲线计算样品浓度。

1.2.5 羟脯氨酸含量检测 羟脯氨酸是胶原蛋白的基本成分，其浓度可反映肉芽组织中胶原蛋白的浓度。各组的肉芽组织在60～70 ℃下干燥24 h，测定干肉芽组织质量。干燥的组织片在6 mol/L盐酸中120 ℃水解18 h。然后用蒸馏水稀释裂解液，用6 mol/L氢氧化钠中和后进行氯胺-T氧化20 min。终止反应，用分光光度计测定A557 nm值。对所有样品进行3次重复的实验，并根据羟脯氨酸的标准曲线测定羟脯氨酸的含量。

1.2.6 HE染色 对新形成的皮肤进行全深度切除，收集后立即将皮肤组织用100 mL/L中性福尔马林固定。将组织依次在750、850、950、1 000 mL/L乙醇和二甲苯中脱水，接着将处理后的组织用石蜡包埋，最后将石蜡包埋的组织切成4 μm厚的切片，进行常规HE染色后用显微镜观察。

1.2.7 Masson染色 将各组伤口标本石蜡切片脱蜡后用梯度乙醇脱水，将脱水后的玻片依次经苏木精、酸性丽春红、0.04 mol/L磷钼酸、苯胺蓝染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封存。光学显微镜下观察各组胶原纤维沉积并采集图像。

1.2.9 体内安全性评价 将20只小鼠随机分为两组(正常对照组和BCP157组)。BCP157组皮下注射500 μg/kg的BPC157，1次/d，连续给药14 d；正常对照组注射相同体积生理盐水，1次/d，连续给予14 d。在最后一次给药24 h后收集血液样本和主要器官组织，以进行血液学和组织化学分析。血液样本由日立7080化学分析仪分析碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、血尿素氮和肌酐等水平。使用多聚甲醛对心、肺、肝、脾和肾等主要器官固定48 h，石蜡包埋后做切片染色。

表1 BPC157对小鼠烫伤模型创面直径及面积变化的影响

2 结果

2.1 BPC157加速小鼠皮肤烫伤伤口的愈合

在小鼠烫伤模型中，皮下注射BPC157后，结果显示BPC157各剂量组及阳性对照组在给药后第3日即可显著促进烫伤创面愈合，给药7 d后BPC157各剂量组及阳性对照组皮肤创面面积较模型组明显缩小(表1，P<0.01)。给药7 d后BPC157剂量组(10、20、40 μg/kg)及阳性对照组的创面愈合率分别为41.179%、47.943%、42.867%和38.373%，模型组创面愈合率仅为12.761%，与模型组比较具有明显的统计学差异(P<0.01)。研究提示BPC157各剂量组明显促进伤口愈合。在小鼠烫伤模型中，与模型组相比，BPC157各剂量组胶原蛋白含量、羟脯氨酸含量均显著增高(P<0.01)，表明BPC157各剂量组的伤口愈合情况明显好于模型组(图1)。

A：小鼠皮肤烫伤图；B：小鼠创面面积；C：小鼠创面愈合率；D：小鼠创面胶原蛋白、羟脯氨酸水平。BPC157：机体保护多肽157。aP<0.05，bP<0.01。图1 BPC157加速小鼠皮肤烫伤伤口的愈合

2.2 小鼠烫伤皮肤组织HE和Masson染色结果

小鼠皮肤组织的HE和Masson染色结果显示，模型组小鼠皮肤表皮及皮肤附属器坏死，损伤表面被大量急性炎细胞及坏死物覆盖，皮下胶原坏死崩解，可见大量炎症细胞浸润，肌层变性坏死，肌层下见急性炎细胞浸润，为深Ⅲ度烫伤。与模型组相比，BPC157给药组表皮及皮肤附属器不同程度修复，BPC157给药组坏死组织边缘见表皮修复，肉芽组织增生，皮下纤维组织增生，表皮及皮肤附属器部分或完全修复，炎症消退。与模型组相比，20、40 μg/kg BPC157组和阳性对照组病变减轻明显，其次为10 μg/kg BPC157组(图2)。

A：HE染色和Masson染色观察小鼠组织病理改变(标尺为100 μm)；B：HE染色修复分数；C：Masson染色修复分数。BPC157：机体保护多肽157。bP<0.01。图2 小鼠烫伤皮肤组织HE和Masson染色结果

2.3 BPC157促进大鼠切口伤的愈合

BPC157各剂量组及阳性对照组在给药后第3日即显示出显著促进伤口愈合作用，缩短大鼠皮肤切割伤愈合时间。给药7 d后，10 μg/kg BPC157组、20 μg/kg BPC157组、40 μg/kg BPC157组及阳性对照组皮肤创面面积较模型组明显缩小，并具有显著统计学差异(P<0.01)。给药7 d后，10、20、40 μg/kg BPC157组及阳性对照组的创面愈合率分别为53.9%(P<0.05)，64.3%(P<0.01)，67.9%(P<0.01)和46.0%(P<0.01)，模型组创面愈合率仅为26.3%，各组与模型组比较具有明显的统计学差异。研究提示BPC157各剂量均明显促进伤口愈合。同时与模型组相比，BPC157各剂量组Ⅰ型胶原蛋白含量、Ⅲ型胶原蛋白含量、羟脯氨酸含量均显著增高(P<0.01，图3)。

A：大鼠创面面积；B：大鼠创面愈合率；C：大鼠创面胶原蛋白、羟脯氨酸水平。BPC157：机体保护多肽157。aP<0.05，bP<0.01。图3 BPC157促进大鼠切口伤的愈合

2.4 大鼠切口伤模型HE和Masson染色结果

分析各组的HE和Masson照片发现，模型组大鼠皮肤表皮变性坏死，破损处皮肤皮脂腺、毛囊等皮肤附属器坏死，缺失，血管扩张、充血，炎细胞浸润、表皮轻微或轻度变性(空泡变)；真皮有轻微、轻度或中度炎细胞浸润，炎细胞类型主要以单个核细胞为主。BPC157给药组大鼠皮肤病理改变较模型组明显减轻，表皮不同程度修复，破损皮肤周围表皮轻微、轻度或重度增厚，坏死组织边缘见表皮修复，皮下见成纤维细胞增生，肉芽组织轻度或中度增生，创面修复，炎症消退。与模型组比较，BPC157各剂量组的病变明显减轻，其次为阳性对照组(图4)。

2.5 体内安全性评价

注射500 μg/kg BPC157的小鼠的主要组织器官未出现明显的组织病理学变化，同时各器官的质量也无明显改变。通过检测重要肝肾损伤指标，发现所有数值均与正常对照组无差异，表明BPC157不会引起明显的肝肾毒性。血清中炎性细胞因子(如IFN-γ、TNF-α和IL-1β)的检测显示，注射BPC157组的小鼠与正常对照组的水平相似，表明BPC157没有诱发小鼠的炎症反应。实验组小鼠在实验期间没有死亡或体质量严重下降的现象发生。上述结果表明，BPC157不会对小鼠的血液系统和主要器官脏器造成急性毒性(图5)。

3 讨论

烫伤和切口伤是临床上最常见的皮肤损伤，通常由于并发症的存在，损伤的修复和愈合过程变得更加困难，对临床的挑战性更大。BPC157作为细胞和器官的保护剂，对各种器官的损伤具有明显的保护作用。在之前的研究中，我们化学合成的BPC157显示出显著的保护作用，在极低剂量(200 ng/kg)下促进急性和慢性胃溃疡的愈合。本研究旨在进一步探究其在皮肤烫伤和切口伤愈合中的作用。

皮肤伤口愈合是指皮肤和其他软组织受到损伤后进行修复的过程，这是一个复杂而动态的过程，涉及受损组织的细胞结构和组织层的修复，主要分为以下几个方面：炎症、增殖和重塑。增殖阶段是至关重要的，以血管生成、胶原沉积、上皮化和伤口收缩为特征[14]。在皮肤烫伤和切口伤模型的治疗中，创面测量数据显示，在BPC157连续给药后3 d，明显促进了创面收缩和闭合，提高了创面愈合率，促进了伤口的恢复。

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，在促进伤口愈合方面具有重要的生理功能。伤口愈合过程在很大程度上取决于新胶原蛋白的生物合成和沉积的调节及其随后的成熟。在增殖阶段，伤口内及周围迁移、增殖的成纤维细胞会分泌Ⅲ型胶原，这种胶原对于在这一阶段形成临时基质是必不可少的。此外，Ⅲ型胶原蛋白促进肉芽组织弹性，减少瘢痕形成。Ⅰ型胶原蛋白在成熟期促进伤口愈合和活力方面也起着重要作用，是未损伤皮肤中最普遍的胶原蛋白[15-16]，通过评估模型组和BPC157给药组的肉芽组织中胶原含量，发现BPC157增强了胶原的合成和沉积，进而促进伤口愈合。胶原蛋白的主要成分是羟脯氨酸，它已被用作组织胶原的生化标志物[17-18]。因此，我们进一步检测伤口部位羟脯氨酸的含量，以确认BPC157对胶原蛋白的上调。我们的实验表明，在应用BPC157治疗7 d后，肉芽组织中的羟脯氨酸含量显著增加，表明胶原蛋白周转率增加。进一步观察HE染色与Masson染色的结果。伤后7 d皮肤HE染色结果显示，模型组的皮肤真皮出现严重坏死、充血，大量炎症细胞浸润。BPC157给药7 d，可显著减轻表皮坏死，减少炎症细胞浸润，增加胶原纤维数量，促进表皮和皮肤辅助修复。同时Masson染色也表明，BPC157使再生皮肤中染色的胶原蛋白和皮肤蛋白的综合光密度增加。

最后，我们使用正常治疗剂量12.5倍剂量(500 μg/kg)的BPC157进行用药安全性评价，连续注射12 d，通过对各器官进行HE染色和器官质量检测，表明超高剂量的BPC157用药不会对小鼠各主要器官产生毒性。通过血液生物化学指标、血清炎性细胞因子和小鼠体质量分析，BPC157不会对小鼠的肝肾功能造成损伤，不会造成小鼠的炎症反应，并且不影响其体质量变化，充分表明在正常用药剂量内，BPC157用药安全性良好。

综上所述，本研究结果揭示了BPC157对皮肤烫伤和切口伤的疗效。BPC157通过增加羟脯氨酸、胶原纤维的产生和沉积来加速皮肤伤口的愈合。这些结果为其在广泛皮肤损伤的临床应用提供了实验依据，同时BPC157具有良好的稳定性和耐受性，目前已被广泛报道，是治疗所有类型严重皮肤损伤的理想候选药物。