基于网络药理学的如意金黄散对坏死性筋膜炎的治疗机制研究

刘永盛，赵 惠，薛小燕，贾 敏，阿拉木斯，姜 超，张 溪，李明凯

1空军军医大学药学系药理学教研室，陕西 西安 710032；2海军91126部队医院，辽宁 大连 116041；3西安市中医院肛肠科，陕西 西安 710016)

坏死性筋膜炎可发于全身各处，主要症状为皮肤溃烂，皮温升高，患者患处剧痛，可因毒血症出现谵妄、休克，最终全身多器官衰竭而死亡[1-2]。坏死性筋膜炎主要由细菌感染引起[3]，中医根据其病机将坏死性筋膜炎划为“烂疔”范畴，因火毒炽盛使得热毒入血，内攻脏腑，而后寒战高热，神昏谵语[4]。1918年，第一次世界大战期间就有该疾病的报道[1]；近年来有因不重视军事训练伤而发展成为坏死性筋膜炎的报道[5]。因此，对该疾病的预防和治疗是军事训练伤救治的重要组成部分。中药复方在抗菌方面不易引起耐药，甚至可以延缓或消除细菌耐药性[6]，且价格低廉，便于储存和应用，有开发成为军队特需药物的潜力。

如意金黄散出自《外科正宗》，收录于2020年版《中国药典》[7]。孙丹等[8]认为方中天花粉用量最大，为君药，作用为排脓消肿；大黄活血散瘀，姜黄行气活血止痛，白芷燥湿排脓共为臣药；厚朴、陈皮燥湿消痰行气，苍术燥湿，天南星消肿止痛，共为佐药；甘草调和诸药，为佐使。研究发现如意金黄散中含有大量具有抗炎、抗菌、调节免疫功能的化学成分[9]，目前临床上多用于治疗各种皮肤感染性疾病，对坏死性筋膜炎的治疗未见报道。网络药理学与中药的系统观、整体观不谋而合，旨在突破“单成分-单靶点”的分子生物学模式，通过“多成分-多靶点”联合作用规律解释药物与疾病之间的作用机制[10]。本研究为后续研究奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 资料

本文使用的数据库及分析工具包括中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)；中药分子机制的生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)；中医药百科全书(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)；在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.

omim.org/)；药物银行数据库(DrugBank online，DrugBank，https://www.drugbank.ca/)；药物基因组学知识库(The Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB，https://www.pharmgkb.org/)；基因卡片数据库(GeneCardsSuite，GeneCards，http://www.

genecards.org/)；治疗靶点数据库(Therapeutic Target Datebase，TTD，https://db.idrblab.net/ttd/)；STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)；Cytoscape软件(版本：3.8.2)；R ClusterProfiler package(版本：4.0.2)；蛋白银行数据库(Protein Date Bank，PDB，https://www.rcsb.org/)；Autodock(版本：4.2.6)；Discovery Studio 2019(版本：19.1.0.18287)；AutodockTools(版本：1.5.6)；PyMOL(版本：2.5)。

1.2 方法

1.2.1 如意金黄散的化学成分及作用靶点筛选 在TCMSP、BATMAN-TCM以及ETCM数据库中，以如意金黄散所属的10味中草药为关键词，检索相关化学成分。为保证收集到的化合物能够在体内发挥较好的治疗效果，根据类药性(drug likeness，DL)进行筛选，其中BATMAN-TCM与ETCM数据库默认选择的化合物均具有较好的DL，而TCMSP数据库的化学成分筛选条件为DL>0.18。根据公共数据库中收集到的化学成分，将与之对应的预测药效靶点进行汇总。其中TCMSP数据库成分对应药效靶点符合率为82.83%，敏感度为81.33%，特异度为93.62%[11]，为提高预测靶点的可信性，在BATMAN-TCM及ETCM数据库筛选预测靶点的条件为预测参数>0.8。

1.2.2 如意金黄散对坏死性筋膜炎的药效靶点收集 在DrugBank、GeneCards、OMIM、PharmGKB以及TTD数据库中，以“坏死性筋膜炎”为关键词检索相关靶点，将搜集到的靶点进行合并去除重复项得到坏死性筋膜炎的疾病靶点。将如意金黄散治疗靶点与坏死性筋膜炎作用靶点取交集后，得到如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的可能药效靶点。

1.2.3 “草药-靶点-疾病”网络构建 将药效成分根据其来源中草药进行分类，并整理好与之相关的作用靶点，将成分靶点关系输入Cytoscape 3.8.2软件之中，根据其相互映射关系构建该网络。将药效成分与生物分子相互作用网络集成至统一的概念框架中，构建药效成分与作用靶点之间的相互关系。

1.2.4 蛋白互作网络构建 蛋白质之间的相互作用在细胞内发生的许多过程中都是至关重要的，包括信号转导、基因表达调控、细胞迁移等。将如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的靶点输入STRING数据库中，将背景基因设定为“Homo sapiens”，其余设定按照默认，构建蛋白互作网络。

1.2.5 GO富集分析和KEGG富集分析 将如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的预测靶点使用R语言“ClusterProfiler package”访问GO和KEGG数据库进行富集分析，GO富集分析从生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞成分(cellular component，CC)三个方面进行，KEGG分析显示出这些靶点富集的通路信息，将GO富集分析的每个方面选择相关度最高的前10个以及KEGG分析相关性最强的前30个进行柱状图和气泡图可视化。

1.2.6 核心治疗靶点的分子对接验证 将筛选出的核心靶点在PDB数据库中搜索并下载与之对应蛋白模型，使用AutodockTools 1.5.6、Autodock 4.2.6软件把预测与之作用的化合物对其进行分子对接，使用Discovery Studio 2019软件对结果进行2D、3D展示，如果结合自由能值≤-5.0 kJ/mol，则认为化合物与作用靶点之间存在较好的亲和力。

2 结果

2.1 如意金黄散的化学成分及作用靶点筛选

按照以上方法得到TCMSP数据库中收录化合物238种，BATMAN-TCM数据库97种，ETCM数据库191种，将搜集到的化合物进行汇总合并重复项后得到了具有良好DL的520种化合物。在TCMSP数据库中搜集到与如意金黄散相关化合物的979个药效靶点，BATMAN-TCM数据库中搜集到462个药效靶点，ETCM数据库中搜集到599个药效靶点，三者汇总后共得到979个药效靶点(图1)。

A：如意金黄散中的化学成分在各数据库的分布情况；B：如意金黄散中的化学成分相关靶点在各数据库的分布情况。BATMAN-TCM：中药分子机制的生物信息学分析工具；ETCM：中医药百科全书；TCMSP：中药系统药理学数据库与分析平台。图1 如意金黄散化学成分及作用靶点在各数据库的分布文氏图

2.2 如意金黄散对坏死性筋膜炎的药效靶点收集

将“坏死性筋膜炎”作为关键词，在DrugBank数据库中搜集得到8个靶点，GeneCards数据库中得到162个靶点，OMIM数据库有62个靶点，PharmGKB数据库存在8个靶点，而TTD数据库中只有1个靶点。将这些靶点汇总取交集后得到232个坏死性筋膜炎作用靶点。将坏死性筋膜炎的疾病作用靶点与如意金黄散的治疗靶点取交集后得到44个药效靶点(图2)。

A：坏死性筋膜炎致病靶点在各数据库的分布情况；B：如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的靶点分布。GeneCards：基因卡片数据库；DrugBank：药物银行数据库；TTD：治疗靶点数据库；PharmGKB：药物基因组学知识库；OMIM：在线人类孟德尔遗传数据库。图2 如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的作用靶点分布文氏图

2.3 “草药-靶点-疾病”网络构建

使用Cytoscape 3.8.2构建“草药-靶点-疾病”互作网络(图3)，该网络共有407个节点，655条边，其中圆形节点代表如意金黄散的化学成分，不同的颜色对应其来源的中草药，绿色方形节点代表如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的44个预测靶点，节点的大小和与之作用的化学成分数量正相关。由此可见如意金黄散可以通过多途径、多靶点的方式治疗坏死性筋膜炎。

图3 如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的“草药-靶点-疾病”网络

2.4 蛋白互作网络构建

将具有治疗作用的44个药效靶点输入STRING(版本：11.0)数据库中，以中等置信度0.400为标准进行蛋白互作网络分析，删除与其他任何节点不具有相互作用的节点后，该网络具有43个节点，377条边，使用CytoNCA数据包对其进行拓扑分析，得到核心的治疗靶点(图4)。每个靶点在网络中的重要程度与其直接相连靶点的个数即点度中心性以及在两个节点间担任最短桥梁的次数即中介中心性直接相关。将筛选条件设定为点度中心性及中介中心性大于2倍中位数，进行2次筛选，最后得到了6个核心靶点，他们分别是Degree为34的ALB，Degree为33的IL-6，Degree为33的TNF，Degree为32的INS，Degree为31的STAT3，以及Degree为26的PTGS2。

图4 蛋白互作网络及拓扑分析图

2.5 GO与KEGG富集分析

使用R语言软件4.0.2调用Bioconductor中的“ClusterProfiler package”数据包访问GO和KEGG数据库进行富集分析，得出P<0.05且qvalue<0.05的所有相关分类，并展示出GO富集分析中每一项排名前10位的富集功能以及KEGG富集分析中排名前30位的信号通路(图5)。GO富集分析结果显示，如意金黄散参与调节坏死性筋膜炎的急性炎症反应、细胞因子正向调节以及氧化应激、脂多糖和抗生素等方面的反应，作用的CC包括蛋白激酶复合体、RNA转录复合体等，MF包括细胞因子与受体结合、信号受体激活剂活性以及蛋白激酶活性等方面。KEGG富集分析结果显示，如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的作用机制主要通过调节IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、以及NF-κB信号通路等一系列与免疫及炎症相关的信号通路。

A：GO富集分析柱状图；B：KEGG估计分析气泡图。图5 如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的GO和KEGG分析图

2.6 分子对接验证

由GO与KEGG富集分析结果可知，在如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的机制中，NF-κB信号通路上的激酶调节作用十分关键。NF-κB复合物以与NF-κB抑制剂(inhibitor of NF-κB，IκB)家族成员复合的非活性状态存在于细胞质中。在传统的激活途径中，IκB被IκB激酶磷酸化，随后降解产生活性NF-κB复合物易位至细胞核，导致炎症的加剧[12]。针对IκB蛋白，根据网络药理学映射分析结果，我们发现了预测与之产生作用的如意金黄散三种药效成分，包括槲皮素、丁香酸和甘草酸，将这三种成分在模型标定的活性位点与IκB蛋白模型(PDB ID：6Y1J)进行分子对接实验。结果显示槲皮素、丁香酸和甘草酸与IκB蛋白的对接自由能分别为-22.9、-27.5、-30.3 kJ/mol，均具有良好的亲和性，可能通过与IκB产生相互作用抑制其降解(图6)。

A：槲皮素与IκB蛋白分子对接图；B：丁香酸与IκB蛋白分子对接图；C：甘草酸与IκB蛋白分子对接图。图6 与IκB蛋白与槲皮素、丁香酸、甘草酸的分子对接图

3 讨论

坏死性筋膜炎早期发病时表现为感染部位的红肿热痛，与普通的蜂窝组织炎类似，但前者痛感强烈，与临床表现不符，出现腹泻、低血压症状且精神状态有改变，皮肤出现出血大疱并局部坏死[13]。由于训练的严肃与繁忙，坏死性筋膜炎很容易被患者及医生忽略，不予重视导致病情恶化，随着病情进展，皮肤颜色转暗、硬化，出现蓝紫色大疱，充满液体，此时真皮结构已经发生破坏，到了后期感染已经蔓延到深筋膜，组织灰白或者棕黄色坏死，毒力因子通过静脉和淋巴蔓延到全身，导致感染性休克，全身器官衰竭，此时患者出现持续性高热及谵妄，极易死亡[14]。针对坏死性筋膜炎的辅助检查指标包括实验室风险指标评分系统，影像学检查以及手指实验，其中手指实验法是坏死性筋膜炎诊断的最佳方法[15]。

对于坏死性筋膜炎的治疗重在控制感染的蔓延，避免由炎症反应引起的机体过度免疫应答导致全身多器官坏死[13]。应用抗生素等杀灭致病菌理论上可以消除坏死性筋膜炎的致病因素，但抗生素的应用导致细菌耐药性不断增强[16]。相比传统临床抗生素疗法，银离子可以直接作用患者伤口，对细菌代谢的多个过程产生毒性作用，所以应用藻酸盐银离子敷料可对患者伤口的感染进行有效控制，进而提升患者伤口愈合效率[17]。然而藻酸盐银离子敷料生产原材料价格昂贵，且制作工艺复杂。与此相比，中药复方治疗方案具有其优势。中药复方具有多靶点的作用机制，对致病菌与宿主多个环节发挥作用，除了杀菌还可抗炎，且不易引起耐药，甚至可以延缓或消除细菌的耐药性。此外，中药还能够做到“祛邪扶正”，通过提高宿主免疫系统清除病原微生物[18]。

有研究表明，如意金黄散中的姜黄酮、没食子酸、木犀草素、小檗碱等有效成分可通过作用于拓扑异构酶Ⅱα、M胆碱型乙酰胆碱受体M2、IL-6、TNF-α，调节磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B、神经活性配体-受体相互作用等信号通路，治疗糖尿病足溃疡；该方中的黄酮类成分可通过参与动脉粥样硬化信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、雌激素信号通路和TNF通路等多个信号通路发挥抗炎作用[19]。在治疗疖肿方面，如意金黄散可以作用于IL-17信号通路、AGE-RAGE信号通路起到治疗作用[19]。本研究发现，如意金黄散中的主要药效成分包括槲皮素、丁香酸、甘草酸等。槲皮素存在于多种草药的茎、叶、种子中，本方中来源于黄柏和甘草，具有显著的抗炎作用，能够抑制炎症介质分泌，降低IKKβ和IκB的磷酸化，从而诱导NF-κB信号通路失活[20]；多种中药之中都含有丁香酸，本方中来自中药厚朴和黄柏，有研究表明该成分具有一定的抗菌和抗炎作用[21]；甘草酸是中药甘草中重要的药效成分，有研究表明甘草中甘草酸含量随生长年限的增加而逐年递增，产地来自内蒙古赤峰、宁夏盐池、新疆阿克苏、甘肃民勤生长周期5年的甘草中甘草酸含量可达到2.7%～4.9%[22]，甘草酸也可以抑制NF-κB信号通路的激活从而抑制炎症反应[23]。上述药效成分为如意金黄散治疗坏死性筋膜炎奠定了药效物质基础。

通过互作网络分析，我们发现ALB、IL-6、TNF、INS、STAT3和PTGS2是如意金黄散发挥治疗作用的核心靶点。其中ALB主要调节体内的血液渗透压，并具有抗氧化调节的活性[24]，与人体免疫调节作用息息相关；IL-6的产生有助于宿主防御感染和组织损伤，在先天免疫应答中，由骨髓细胞在感染或组织损伤部位通过Toll样受体识别病原体后合成，可促进B细胞分化为免疫球蛋白分泌细胞[25]。TNF由巨噬细胞分泌，其主要作用是调节T细胞功能[26]。INS在整个代谢活动中至关重要，其发挥作用主要是通过与其受体结合，引起下游的信号通路级联反应，最主要的就是NF-κB通路。研究表明INS可以拮抗NF-κB通路激活，抑制炎症反应发生[27]。STAT3介导细胞对白细胞介素、KTELG/SCF、LEP和其他生长因子的反应，通过调节幼稚CD4 T细胞分化为T辅助性T17或调节性T细胞作为炎症反应的调节剂[28]。PTGS2是负责产生炎症前列腺素的主要同工酶，是非甾体抗炎药的主要作用靶点，对其抑制可显著减轻炎症和疼痛症状[29]。GO和KEGG富集分析的结果显示，如意金黄散通过“多靶点-多途径”的方式对坏死性筋膜炎进行治疗，其中NF-κB信号通路具有非常重要的作用。抑制NF-κB信号通路可减弱机体炎症反应，缓解免疫过表达状态，从而减轻机体损伤。NF-κB是一种几乎存在于所有细胞的转录因子，是信号转导的终点，由一系列外部刺激的生物过程引起，例如细胞生长、分化、肿瘤发生、免疫、炎症和细胞凋亡[30]。

我们使用网络药理学分析了如意金黄散治疗坏死性筋膜炎的作用机制，并初步明确了关键的药效成分及作用靶点。在后续的工作中，我们将对预测的药效成分及作用机制进行实验验证，并将药效成分进行组方处理起到“增效减毒”的治疗效果，为坏死性筋膜炎治疗药物的研发奠定基础。