直接进样-气相色谱质谱法快速测定芝麻香白酒及酒醅中吡嗪类风味组分的研究

吕晓凤，孟 武，刘玉涛，张梦梦，卢春玲，李 强，马春莲，邱振清，韩云翠，赵巧珍，胥鑫钰，高红波

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东济南 250353；2.济南趵突泉酿酒有限责任公司技术质量部，山东济南 250115；3.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015）

白酒是我国特有的传统酒种，更是中国人民智慧的象征。自中国建国以来，芝麻香型白酒一直是中国的创新白酒之一，综合感官具有焙烤芝麻香的优雅细腻，其生产工艺更是结合酱香、清香、浓香3种白酒香型的特点，独成一家[1]。

芝麻香白酒及其酒醅中存在吡嗪类风味组分，吡嗪类风味组分主要贡献为坚果香、焙烤香。吡嗪类风味组分的香气阈值高，浓度低，OAV 值较小，但其对一些白酒起到重要的作用。吡嗪是在1,4 位含氮的六元杂环化合物，其衍生物在自然界中非常丰富，特别是在食品和饮料中，是一类重要的食品杂环香料[2-4]。自然界中存在着各种形式的吡嗪类化合物，也是各类香型白酒中均可检出的一类微量健康成分[5-7]，尤其是在酱香型白酒和芝麻香白酒中含量较多，具有特殊的焦糊香和独特的健康功能。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，是酱香型、芝麻香型白酒中极其重要的香气物质[8]，有焙烤芝麻、可可等气味[8-10]，四甲基吡嗪作为川芎的有效药用成分，在心脑血管方面有显著效果，同时作为香料广泛应用于食品调香中[11-16]。当今社会，人们追求风味健康双导向，在追求风味的同时，更加关注健康功能[17]。因此，对于吡嗪风味组分的检测成为主要研究方向。近年来，王佳琳[18]在研究一种格瓦斯饮料的制作时，创建了一种固相萃取-气相色谱法来测定四个主要的吡嗪化合物，并且分析比较3 种萃取头，得出最佳萃取头为75 μm CAR/PDMS；程伟[19]在研究馥合香白酒的风味特征时，采用SPME-GC-MS 结合OAV 进行金种子酒的分析与感官评价；龙四红等[17]建立高效液相色谱（HPLC）法测定白酒中8 种吡嗪类化合物含量的方法，并进行了方法学研究；苏宁等[20]建立了一种测定高温大曲中吡嗪类化合物含量的方法，采用直接进样法进GC-MS，进行分析；乔慧等[21]应用气相色谱与NPD 检测器联用技术，建立了快速测定白酒中吡嗪类化合物的方法；王莉等[22]采用气相色谱-质谱-离子扫描联用法快速检测白酒中4 种吡嗪类化合物。本研究采用直接进样法-GC-MS 对芝麻香白酒及酒醅中吡嗪类风味组分进行检测，总共检出8 吡嗪类风味组分，该方法与固相微萃取相比更加简洁、高效。

芝麻香白酒及其酒醅中吡嗪类风味组分含量与酸、酯、醇类相比，含量甚微，因此其定性定量存在一定程度的困难。本试验采用直接进样-气相色谱质谱法对芝麻香白酒以及酒醅中的吡嗪类味组分进行测定，建立直接进样-气相色谱质谱法快速测定芝麻香白酒以及酒醅中的8 种吡嗪类风味组分的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

试验样品：芝麻香型白酒，来自济南趵突泉酿酒有限责任公司；酒醅，取自济南趵突泉酿酒有限责任公司芝麻香手工酿造班组入池酒醅。

试剂及耗材：无水乙醇（色谱纯）；内标物：2-甲氧基-3-甲基吡嗪；吡嗪类标准品：2-甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2-乙基吡嗪。内标物与吡嗪类标准品，纯度均为99.9%，均购于百灵威科技有限公司。

仪器设备：气相色谱质谱联用仪（安捷伦7890 A-5975 C)；恒温磁力搅拌器；磁力转子；移液枪；秒表；FA2004 精密电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；UPR 超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；KQ2200E 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 气相色谱分析条件（表1）

表1 气相色谱分析条件

1.2.2 质谱条件(表2)

表2 质谱分析条件

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 吡嗪类混标储备溶液（100 mg/L)

准确称取2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、四甲基吡嗪标准品各0.01 g（精确至0.0001 g）于容量瓶中，使用无水乙醇定容至100 mL，配制成100 mg/L 的混合标准储备液。

1.2.3.2 吡嗪类混合标准中间液（10 mg/L)

准确吸取10 mL吡嗪类混标储备溶液（100 mg/L)于100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶液定容至100 mL，配制成10 mg/L的混合标准中间液。

1.2.3.3 2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标储备液（100 mg/L)

准确称取0.01 g（精确至0.0001 g）2-甲氧基-3-甲基吡嗪标品于100 mL 容量瓶中，用无水乙醇溶液定容，配制成浓度为100 mg/L 的2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标储备溶液。

1.2.3.4 2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标使用液（10 mg/L)

准确吸取10 mL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标储备液（100 mg/L)于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，配制成浓度为10 mg/L 的2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标使用液。

1.2.3.5 吡嗪类混合标准工作液的配制

分别取适量吡嗪类混合标准储备液于容量瓶中，用无水乙醇溶液定容混匀，逐级稀释成一系列的标准梯度浓度，待用。

1.2.4 样品前处理

1.2.4.1 芝麻香白酒样品

准确吸取芝麻香白酒1 mL，加入100 μL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标溶液(10 mg/L)，压紧瓶盖后，快速摇匀器进行摇匀。

1.2.4.2 芝麻香酒醅样品

取酒醅5 g，加15%无水乙醇（色谱纯）30 mL，超声30 min，10000 r/min 离心5 min，离心后经0.22 μm 无机滤膜进行过滤，吸取1 mL 滤液放入进样瓶中，加入100 μL 2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标溶液(10 mg/L)，压紧瓶盖后，快速摇匀器进行摇匀。

1.2.5 定性定量方法

定性：SCAN 模式下，使用NIST 08 标准光谱库进行定性，以确定被监测离子的参数。

定量：根据SCAN 检测模式得到的离子检测参数，建立SIM 检测模式，利用内标-标准曲线法定量。

1.2.6 检出限、精密度、重复性实验

以信噪比S/N 为3，计算出方法的检出限；在同一试样中分别加入3 个不同浓度水平的标准品进行加标回收实验；每个浓度分别做6 个平行样品，以6 个平行样品实验数据的相对标准偏差，作为该方法的精密度（relative standard deviation,RSD)。

2 结果与分析

2.1 标品、样品的定性定量检测分析

通过表3 的定性定量分析，确定了8 种吡嗪类化合物的定量离子，通过保留时间与定量离子，建立8 种吡嗪类化合物的SIM 检测模式，根据内标法，建立吡嗪类风味组分的标准曲线，其中，芝麻香白酒中8种吡嗪类化合物色谱图见图1。

图1 芝麻香白酒中8种吡嗪类化合物色谱图

表3 8种吡嗪类风味组分监测离子参数

2.2 标准曲线线性方程、线性范围、相关系数和检出限

所制备的标准溶液在最佳色谱条件下进行分析，以标准溶液质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为横坐标，绘制标准曲线，得到8 种吡嗪类物质的标准曲线线性方程、线性范围、相关系数见表4。

表4 8种吡嗪类物质的标准曲线线性方程、线性范围、相关系数

由表4 可知，在100～5000 μg/L 质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R2均在0.999以上，符合准确定量的要求。

2.3 重复性实验以及加标回收率实验

取芝麻香白酒样品，检测吡嗪类风味组分含量，根据测定含量分别加入250 μg/L、500 μg/L、1000 μg/L 浓度的吡嗪标准品进行加标回收试验，每个浓度分别做6 个平行样品，以6 个平行样品实验数据的相对标准偏差，作为该方法的精密度（relative standard deviation,RSD)，结果见表5。

表5 方法的精密度及回收率试验结果

由表5 可知，8 种吡嗪类风味组分的RSD≤10，结果证实该方法具有良好的重现性；8 种吡嗪类风味组分的平均回收率在87%～110%之间，表明该方法是可行的，因此可以满足本研究中对芝麻香白酒中吡嗪类风味组分测定的实验要求。

2.4 样品检测-验证性分析实验

用所建立的方法对六个芝麻香白酒样品以及堆积过程中酒醅吡嗪类风味组分含量进行测定，结果见表6、表7。

表6 芝麻香白酒酒样中吡嗪类风味组分的测定

表7 堆积过程吡嗪类风味组分的测定

由表6 可知，从吡嗪类风味组分总量分析，2#酒样远高于其他酒样，然后依次是3#和4#酒样、6#酒样，1#酒样和5#酒样的含量相对较低。1#酒样中总的含量最低，除2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量相对较高，其他物质都很少。2#酒样中除2,5-二甲基吡嗪外，其他吡嗪均高于其他酒样，尤其是2,3-二甲基吡嗪高于其他酒样。3#酒样中四甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪含量较为突出。4#酒样中2,5-二甲基吡嗪的含量高于其他酒样，另外2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪含量较高。5#酒样中四甲基吡嗪含量较高，2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪均为220～270 μg/L。6#酒样无论从总量还是各类吡嗪的含量而言，与4#酒样比较接近。

堆积过程中，芝麻香酒酿造原料含氮量高，采用高温大曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒的生产工艺，有利于美拉德反应的发生，所以含氮化合物含量高，特别是吡嗪类化合物含量高[23]。但是表7结果反映出在堆积过程中，除了2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪有较为明显的升高，其他吡嗪类并没有显著提高。推测可能由于堆积时间短，美拉德反应未完全进行或只产生部分前体物质。结果表明，该方法可以用于芝麻香白酒以及酒醅中8 种吡嗪类化合物的快速检测。

3 结论

基于直接进样-气相色谱质谱法，快速测定芝麻香白酒及其酒醅中8 种吡嗪类化合物，结果表明，8 种吡嗪线性相关系数均大于0.999，方法最低检出限为10 μg/L，加标回收率为87%～116%，相对标准偏差为3 %～10 %。该方法采用内标法定量，准确度高、精密度好，可用于芝麻香白酒以及酒醅中吡嗪类风味组分的常规检测。

堆积过程是一个开放式的发酵过程，可以网罗空气中的微生物进行联合发酵。2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪有较为明显的升高，其他吡嗪类并没有显著提高，推测可能由于堆积时间短，美拉德反应未完全进行或只产生部分前体物质，后续可以进行具体机理的深入研究。