柞蚕滞育的研究进展

2023-12-29陈俊山刘书禹刘凤全谌苗苗刘佩锋

北方蚕业 2023年3期

陈欣陈俊山刘书禹刘凤全徐亮谌苗苗赵贺刘佩锋

(辽宁省蚕业科学研究所,辽宁凤城 118100)

柞蚕(Antheraeapernyi)是一种具有重要综合价值的泌丝昆虫,在分类学上属于昆虫纲、鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属。柞蚕业起源于中国,距今已有2000多年的发展历史,是我国山区农民脱贫致富的特色优势产业。当前全国柞蚕茧总产量约占世界总产量的 90%以上,柞蚕资源的综合利用价值得以不断开发,使得这项传统产业具有更加广阔的发展前景[1]。

滞育是昆虫渡过不利时期的一种重要的生理过程,是由中枢神经系统和激素调控的适应性发育抑制事件,通常在不利环境到来之前开始发生,且不会随不利环境的消失而立即结束,在昆虫的生存、进化和繁殖等方面发挥着重要的作用[2]。柞蚕是完全变态昆虫,在一生中要经历卵、幼虫、蛹和成虫4个形态和生理机能完全不同的发育阶段,以蛹态滞育,属兼性滞育昆虫,其每个世代的生活周期较长,一般最多为三化。在自然状况下,柞蚕滞育的发生与解除,是适应环境所产生的遗传性生理过程,柞蚕的遗传性(化性及化性的稳定性)和环境因子(光照、温度、营养等)均与滞育的发生及解除有密切关系[3]。

由于柞蚕产业具有巨大的社会效益,研究并掌握、调控其滞育机制,可实现柞蚕放养技术的改革、育种手段的创立以及营养价值的高效利用,可见研究利用柞蚕滞育机制,对于柞蚕业的可持续发展具有重要作用。

1 柞蚕滞育特性

1.1 滞育虫态

研究表明,滞育在不同的昆虫中所发生的虫态也有所不同,如卵滞育、幼虫滞育、蛹滞育和成虫滞育[4]。柞蚕是蛹态滞育的昆虫,佟秀云经过连续3年的观察试验,总结出柞蚕滞育蛹进入滞育期的重要标志是:蛹长与胃长之比接近100∶37,胃质浓缩变硬[5]。

1.2 滞育阶段划分

依据滞育在昆虫个体间发生的状况将其分为3个主要时期: 滞育前期,滞育期,滞育后期。根据生理生态特点,滞育前期进一步细分为诱导阶段、准备阶段2个亚时期,滞育期细分为启动、维持、解除3个亚时相[2]。

1.2.1 滞育前期

诱导阶段:以蛹滞育的昆虫,感应刺激的敏感阶段多在幼虫期[6],柞蚕在蛹化前的最后两个龄期即柞蚕的壮蚕期(4—5龄幼虫称为壮蚕)最为敏感[7],接受到特殊的环境信号,诱导其在后期注定进入滞育。

准备阶段:在准备阶段,柞蚕壮蚕期食量增加,生长到5龄末期,会在树枝间徘徊,寻找适合营茧的场所,为进入滞育做准备。

1.2.2 滞育期

昆虫滞育期的长短在不同种类、同种不同种群间、个体间均存在较大差异,从几周至数月甚至长达1年以上[8],二化性柞蚕秋蛹的滞育期大约在1个月左右[9]。

启动:在这阶段,昆虫个体新陈代谢受到抑制,形态发生停止[2]。二化性柞蚕秋蛹在化蛹后第30天呼吸强度迅速降至极低水平,耗氧量仅为化蛹后第28天的1/3左右,表明此时蛹体已进人滞育状态[9]。

维持:在这个阶段,昆虫个体发育完全停滞,且不会随环境变化而有所改变[2]。处于最低水平的呼吸强度已成为昆虫滞育的主要生理特征[10],二化性柞蚕秋蛹呼吸强度从化蛹后第30天直到化蛹第53天一直维持在较低水平,形成整个呼吸曲线的谷底,并且此时呼吸强度受温度影响较小,这充分表明蛹体在此阶段已处于滞育状态[9]。

解除:许多昆虫滞育的解除需要严格的外界条件,滞育解除目前尚缺乏明显的标志,需要进一步研究[11]。

1.2.3 滞育后期

滞育解除后,环境条件尚不能满足直接发育的恢复,发育和新陈代谢仍为外源条件所抑制[2]。张义成的研究表明,二化性柞蚕秋蛹在化蛹后第56天呼吸强度迅速上升,此后至化蛹第153天始终处于较高水平,并随温度变化波动,表明此时已进入滞育后期阶段,但由于正值冬季气温较低,故蛹体也不能正常发育[9]。

2 环境因子对柞蚕滞育的影响

在影响昆虫的滞育的诸多外界环境因子中,光照和温度是最主要因素,湿度和食料次之。其中以光周期最为重要[12]。

2.1 非生物因子的影响

2.1.1 光周期的影响

诱导昆虫滞育的光周期反应类型分为长日照反应型、短日照反应型、短日照-长日照反应型和中间日长反应型4种[13]。利用光周期反应可以确定临界光周期,当光照时长低于或高于临界光周期时,就会诱导昆虫滞育的发生[14]。柞蚕幼虫期,特别是壮蚕期光照的长短可直接影响滞育的发生与否,关于柞蚕滞育临界光周期前人做了许多相关试验,试验结果较为一致,认为柞蚕为短日照反应型,引起其滞育的临界光周期为14 h左右,且确认脑部是柞蚕幼虫对于光线的直接感受器[3]。

柞蚕壮蚕期光照是引起柞蚕滞育的首要原因,但是处于临界中间光照条件下,卵期光照也发挥作用。我国柞蚕的化性以北纬35°为分界线,北纬35°以北地区为二化性地区,以南地区为一化性地区,在一化性和二化性之间的过渡区域,为柞蚕化性不稳定地带[1]。在这个不稳定地带,研究发现柞蚕卵期感光是发生滞育的主要原因,但与壮蚕期短日照滞育型不同,柞蚕卵在短光照下不滞育,长光照引发滞育[15],同时试验证实,柞蚕卵的光照敏感时期为胚胎发育在单眼着色至孵化前[16]。

光周期不仅显著影响柞蚕滞育的诱导,也影响滞育的维持和解除,相关实验证明,短光照使蛹体维持正常滞育,利用长光照可以解除滞育,且不同化性品种解除滞育时所需光照处理时间有所差异[17,18],可见柞蚕的遗传性(化性及化性的稳定性)对滞育的发生与解除同样关系密切。而且,研究证明,脑部是柞蚕滞育蛹接受光刺激的器官[19]。

2.1.2 温度的影响

温度对滞育的影响仅次于光周期,高温对滞育产生抑制作用[7],低温有利于维持滞育[20],且低温是蛹滞育解除蛹滞育的必要条件,未经低温处理的滞育蛹,利用光周期无法解除滞育,且与光照感受器官相同,接受温度感应的器官也在柞蚕脑部[20]。

2.2 生物因子的影响

影响柞蚕滞育的生物因子主要是食料因子。相关研究表明,柞蚕滞育蛹的产生与否,随幼虫营养期积累的多少而定,积累多的蛹滞育,积累少的蛹不滞育,而营养积累的多少,又取决于壮蚕期每天摄食时间的长短以及柞叶柔嫩程度,而摄食时间长短以及柞叶柔嫩程度又与环境条件密切相关[21],可见食料因子是作为光周期和温度反应的调节因子对昆虫滞育发生影响的。

3 柞蚕滞育的生理生化基础

3.1 滞育的激素调控作用

目前对昆虫滞育调控机制的阐明主要从神经内分泌系统的激素调节层面,其调控机理因滞育虫态不同也各不相同。蛹滞育主要发生在鱗翅目昆虫和双翅目昆虫中,由脑、前胸腺、咽侧体三者相互作用,参与调控的激素最主要是促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone, PTTH)、蜕皮激素(Molting hormone, MH)[22,23]。

在柞蚕的滞育诱导过程中,当柞蚕幼虫脑接收到能引起滞育的环境信号以后,蛹脑的PTTH的合成和释放就减少,从而使前胸腺停止分泌MH,使得蛹的发育停滞,从此进入了滞育期[24]。

在柞蚕蛹解除滞育过程中,由脑合成的PTTH增加,促使前胸腺合成分泌MH,MH先后和一些受体复合物结合,诱导一些早期基因的转录,这些基因的转录激活了一系列参与蜕皮和变态过程[25],蛹期血淋巴中MH滴度下降后,促使由脑合成释放羽化激素(Eclosion hormone, EH),来调节气门腺蜕壳启动激素(Ecdysis triggering hormone, ETH)的分泌,最终在这一系列的激素调控下完成蜕皮及羽化过程[26]。

3.2 滞育的营养物质储备与代谢

柞蚕体内的物质代谢,是蛹体滞育与否的物质基础,柞蚕唯一摄取食物的时期为幼虫期,其中五龄期占取食量的80%以上[27],因此五龄幼虫期奠定了柞蚕蛹滞育的物质基础。

3.2.1 脂类物质代谢

滞育性柞蚕体内游离脂肪的含量在五龄盛食期以后显著高于非滞育性柞蚕,而游离脂肪是可利用的能源物质,说明滞育性柞蚕体内大量积累游离脂肪是为了滞育做准备[27]。

3.2.2 糖类物质代谢

目前滞育昆虫的糖原代谢途径主要分为糖醇积累型和海藻糖积累型这2种类型,因昆虫种类而异[28]。柞蚕属于海藻糖积累型,滞育性柞蚕自五龄盛食期开始体内大量积累脂肪体糖原,进入滞育后糖原转化为海藻糖,滞育解除后海藻糖又转化为糖原。表明蛹体脂肪体糖原与血淋巴海藻糖之间互相转化,且这种转化受温度影响,接触低温越早,温度越低,海藻糖积累速度越快,积累量越高,峰期持续时间也越长,可以加深滞育强度,有利于维持滞育[20]。

排除标准：①斜视（显斜视）；②任何眼部器质性疾病，如白内障、上睑下垂等；③伴有颅内疾病；④眼部手术史。

3.2.3 氨基酸变化

柞蚕滞育蛹体内共有16种氨基酸,其中脯氨酸含量最高[29],进一步说明脯氨酸与昆虫耐寒性相关[30]。柞蚕滞育蛹血淋巴中的游离氨基酸含量随着滞育的解除而逐渐降低,说明柞蚕蛹解除滞育后发育至成虫阶段,需要消耗大量的游离氨基酸,可见游离氨基酸作为代谢的中间产物,用于滞育期间和滞育解除后昆虫的合成代谢与分解代谢[31]。

3.2.4 蛋白质变化

蛋白质含量与昆虫滞育的诱导和解除密切相关[32],滞育性柞蚕体内蛋白质的增加在五龄盛食期以后显著多于非滞育性柞蚕[33],说明柞蚕体内蛋白质的变化与发生滞育相关。

此外,滞育昆虫在进入滞育前还会积累一种特殊的贮藏蛋白来存贮氨基酸,这些蛋白在滞育期间持续合成,维持较高浓度,且滞育终止后即消失,它被认为与滞育的发生有关,因而被称为滞育关联蛋白(DAP)[34,35]。目前已在多种昆虫滞育虫态的血淋巴或脂肪体中发现DAP的存在,柞蚕体内同样有DAP的存在,但是其具体作用机制还不明确[36,37]。

4 柞蚕滞育调控的分子机制

4.1 促前胸腺激素基因克隆及表达

李慧君克隆了柞蚕促前胸腺激素基因ApPTTH,通过表达分析,得到一些重要发现[24]:①在柞蚕5龄早期幼虫的脑组织中检测到ApPTTH的表达,这与ApPTTH参与滞育的诱导有关,在其卵巢组织也检测到ApPTTH的表达,但其表达机理有待研究;②qRT-PCR实验发现,ApPTTH的表达量在滞育过程中变化不大,而在解除滞育要进入成虫发育时ApPTTH的表达量升高而达到最大值,说明ApPTTH的表达及合成对滞育蛹解除滞育及成虫发育至羽化具有有重要作用。

4.2 蜕皮激素受体相关基因克隆及表达

在柞蚕中已经克隆了两个蜕皮激素受体相关基因,ApEcRB1和ApUSP1。对这两个基因的qRT-PCR实验表明,柞蚕幼虫蜕皮期间,ApEcRB1呈上调表达,可见ApEcRB1在此期间参与蜕皮激素信号的接收,2个基因在化蛹期均呈现大幅度上调表达的规律,反映出这两个基因在柞蚕变态发育中发挥作用;利用蜕皮激素诱导滞育蛹羽化的试验中,发现滞育蛹中2个基因的表达量在注射20-羟基蜕皮甾酮(20E)后均明显下降,在羽化前期表达量开始上升,且在蛹发育16 d(羽化前1 d)达最高,说明这 2个蜕皮激素受体基因的表达与羽化过程中的形态变化有关联,可能参与了组织器官的形成[38]。

4.3 代谢调节的分子机制

昆虫滞育机制的研究表明其主要受激素调节,但是这些激素所涉及的信号通路,包括昆虫进入滞育前的生理准备,滞育维持需要的生理生化反应及滞育的打破,都需要相关酶类和蛋白质的参与和协作。

4.2.1 海藻糖酶参与的调节机制

作为昆虫的血糖,海藻糖(trehalose)含量及海藻糖酶(trehalase,Treh)活力变化与昆虫滞育、滞育的解除和发育密切相关[39]。为了利用海藻糖,昆虫的许多组织拥有海藻糖酶,通过基因克隆、蛋白纯化和酶活性测定结果发现昆虫存在两种不同类型海藻糖酶基因( Trehalase,Treh)。目前在柞蚕上已经克隆获得了两个可溶性海藻糖酶基因(Treh1):ApTreh1A、ApTreh1B,和一个具有跨膜结构的膜结合型海藻糖酶基因(Treh2):ApTreh2。通过表达分析发现,各组织中ApTreh2比ApTreh1的分布更广且表达量更高。qRT-PCR实验表明,长光照处理后,柞蚕蛹脂肪体中ApTreh1A和ApTreh1B在21d时表达量都快速升高,ApTreh2 伴随滞育的解除表达量逐渐升高,在28 d 时达到峰值,42d 时再次出现一个小高峰。以上实验结果表明3个基因在柞蚕光照解除滞育及发育过程中均发挥重要作用,而且因在柞蚕滞育和发育过程中,各组织糖代谢途径有所不同,3个基因的调控功能也不相同[40]。

4.2.2 柞蚕滞育关联蛋白参与的调节机制

目前已在NCBI检索获得了两个柞蚕滞育关联蛋白(DAP)基因的序列,柞蚕滞育关联蛋白基因2(diapause-associated protein 2,dap2),和柞蚕滞育关联蛋白3(diapause-associated protein 2,DAP3)。序列比对分析显示,DAP2与烟草天蛾和家蚕眼色素结合蛋白(OBP)同源性可达到56%和57%,其编码基因在滞育蛹中的转录及表达水平最高,推测其可能参与柞蚕滞育活动中,但是具体的作用机制还不明确[36];DAP3基因主要在蛹期表达,并随着滞育进程逐渐降低,通过与与家蚕滞育时钟蛋白TIME-EA4的空间结构比对,表明两者具有高同源性,推测其在滞育解除过程中可能发挥类似的功能[37]。

5 滞育在柞蚕生产中的应用

由于柞蚕的滞育对生产影响较大,还必须进行深入研究,掌握其机制,在生产中加以调节控制,最大限度地利用自然资源,实现柞蚕生产的优质高产。滞育在柞蚕生产应用中的作用主要体现在以下三个方面。

一是改革柞蚕的放养系统,创立“二化一放”放养技术和“一化二放”放养技术。这就需要充分掌握柞蚕的滞育诱导、维持和解除的技术方法,适时诱导柞蚕滞育,适当加深其滞育强度,从而延长柞蚕种茧的贮藏时期,在因为无霜期短而无法完成春秋两季柞蚕放养的二化性地区实现“二化一放”放养技术[41],以及创建人工解除柞蚕滞育蛹的方法,适时打破其滞育,在温度适宜的一化性蚕区增加一次秋季放养实现“一化二放”放养技术[42,43],从而充分利用各化性地区的气候和丰富的柞树资源。

二是选育柞蚕新品种,建立化性的综合条件逆向选择技术。这就需要研究柞蚕化性的遗传规律,同时充分了解并利用季节、地点、光照、温度、叶质等最不利于柞蚕滞育的环境因子,从而选育在二化性地区能够高滞育率的、化性稳定的一化性品种[44]。

三是柞蚕营养价值的高效利用。已有研究表明,滞育蛹和轻度发育蛹培育的蚕蛹虫草的出草率明显高于用解除滞育蛹培育蚕蛹虫草的出草率,且生产出的蛹虫草营养价值更高[45],这与柞蚕滞育蛹体内营养物质积累有关,因此研究清楚柞蚕滞育的生理生化基础,对柞蚕营养价值的应用同样非常重要。