玫瑰茄水提物抗氧化及抑菌活性研究

欧小勇，潘文章，杨通莲，欧工华

（贵州省从江县动物疫病预防控制中心，贵州 从江 557400）

2020 年，中华人民共和国农业农村部公告第194 号文件指出，为维护我国动物源性食品安全和公共卫生安全，决定停止生产、进口、经营、使用部分药物饲料添加剂。随着该公告的颁布，多种促生长的药物添加剂及抗生素不得在饲料中使用。因此，寻找富含生物活性物质、毒副作用小且残留性低的植物提取物添加剂迫在眉睫[1-2]。玫瑰茄（Hibiscus sabdariffaL.）属锦葵科木槿属药食同源类植物，其花萼色彩鲜艳、色质好，富含有机酸、花色苷、多酚、多糖及黄酮等活性成分，具有抗氧化、抗癌及降血糖等功效[3-5]，广泛用于食品、化妆品等领域[6]。除此之外，近年来国内外研究还发现，玫瑰茄还具有防治心血管疾病和杀菌驱虫等功效[4-5]。目前，国内对玫瑰茄的研究集中在其醇提花色苷的抗氧化和抗肿瘤作用等方面。刘小琳等[5]发现，玫瑰茄醇提花色苷具有较强的抗氧化能力，清除羟自由基的IC50值为169.1 μg/mL，优于VC 的448.5 μg/mL。Malacrida 等[7]和Lin 等[8]研究表明，玫瑰茄花色苷对乳腺癌和胃癌肿瘤细胞的生长均有显著的抑制作用。而关于玫瑰茄水提物的抗氧化及抑菌活性鲜有报到。基于此，笔者以玫瑰茄水提物为研究对象，探索玫瑰茄作为饲用抗氧化剂及抑菌防腐剂时的综合利用效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的玫瑰茄购买于云南省武定县，生产标准号为Q/LAKX0009S，其他试剂还有1,1–二苯基–2–三硝基苯肼（DPPH，梯希爱上海化成工业发展有限公司），FRAP、ABTS 总抗氧化能力检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），抗坏血酸（VC，阿拉丁公司），盐酸金霉素（中国食品药品检定研究院），胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠等（国药集团化学试剂有限公司）。供试的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及肠炎沙门氏菌均购自中国典型培养物保藏中心。主要仪器设备有全波段酶标仪（帝肯InfiniteM 200PRO 型）、紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平UV 2400 型）。

1.2 玫瑰茄水提物（HWE）的制备

将玫瑰茄花萼置于粉碎机中粉碎，以料液比1 ∶25 的配比将玫瑰茄花萼粉末加入蒸馏水中进行超声提取，提取液真空抽滤后旋转蒸发至黏稠状，移入低温真空冷冻干燥箱，干燥后碾压成粉末状，装入密封袋于－20℃冰箱保存备用。

1.3 DPPH 自由基清除能力测定

参考杨丽华等[9]的方法，准确配制1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 和0.1 mg/mL 的HWE 乙 醇 溶 液 及2.0×10-4mol/L 的DPPH 乙醇溶液。吸取DPPH 乙醇溶液3 mL，加入无水乙醇3 mL，标记为A0；分别取不同浓度的HWE 乙醇溶液3 mL，加入DPPH 溶液3 mL，标记为A1；分别取不同浓度的HWE 乙醇溶液3 mL，加入无水乙醇3 mL，标记为A2；所有溶液避光反应30 min，采用紫外可见分光光度计测定517 nm 波长处的吸光度值，每个样品平行测定3 次取其平均值，以VC 为对照。用公式（1）计算HWE 的DPPH 自由基清除率（Y）。

1.4 FRAP 及ABTS 总抗氧化能力测定

准确配制1、2、4、6、8 和10 mg/mL 的HWE乙醇溶液。采用FRAP 及ABTS 总抗氧化能力检测试剂盒测定HWE 乙醇溶液的FRAP 及ABTS 总抗氧化能力，具体操作参照说明书及文献[10-12]的方法进行。图1 为FRAP 及ABTS 总抗氧化能力测定标准曲线，标准曲线在一定浓度范围内线性关系均表现良好。

图1 FRAP（左）及ABTS（右）总抗氧化能力测定标准曲线

1.5 抑菌活性测定

1.5.1 LB 液体培养基及固体培养基的配制 参考罗飞亚[13]的方法配制LB 液体培养基和LB 固体培养基。LB 液体培养基中各成分比例为酵母粉（g）∶胰蛋白胨（g）∶氯化钠（g）∶无菌水（mL）＝1 ∶2 ∶2 ∶200，LB 固体培养基中各成分比例为酵母粉（g）∶胰蛋白胨（g）∶氯化钠（g）∶琼脂粉（g）∶无菌水（mL）＝1 ∶2 ∶2 ∶3 ∶250，培养基配好后用封口膜密封，于立体式高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20 min，待冷却到室温后，放于4℃冰箱备用。

1.5.2 菌种的复苏与纯化 参照菌种使用说明书及何涛[14]的方法，在超净工作台里取出新购菌种，分别接种到装有适量LB 液体培养基的离心管中，置于台式恒温振荡器中37℃培养12 h；然后在超净工作台中将培养液接种到固体培养基上进行纯化，一般至少传3 代后再用接种环挑取单菌落于液体培养基中振荡培养12 h 待用；纯化后的菌液用之后60%甘油制成甘油菌，具体比例为0.8 mL 菌液+0.4 mL60%甘油，置于－80℃冰箱冷藏保存。

1.5.3 纸片抑菌法活性评价 参照文献[15-16]的方法，将HWE 用20%DMSO 水溶液溶解并过0.22 μm 滤膜，然后将HWE 浓度依次稀释成200、100、50 和25 mg/mL，以相同溶剂配制10 mg/mL 的盐酸金霉素溶液作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照，在配制好的药液中加入无菌纸片（d=6 mm）浸泡12 h。吸取200 μL 菌悬液（浓度为1×105～2×105CFU/mL）于培养基的表面，用无菌涂布棒均匀涂布；将已浸泡过药剂并沥干的无菌滤纸片用无菌镊子夹取贴在固体平板上，每个培养皿贴6 片，置于37℃恒温培养箱中下培养24 h，采用十字交叉法[17]测定抑菌圈大小，取3 组平均值。

1.5.4 MIC 与MBC 评价 参照文献[18-19]中的二倍稀释法，用20%DMSO 水溶液将HWE 配制成100 mg/mL 的药液，过0.22 μm 滤膜，用LB 液体培养基稀释至50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 和0.78 mg/mL，将各浓度药液取100 μL 依次加入96 孔细菌培养板的前8 个孔中，然后每孔均加入100 μL 已经稀释好的菌液，第9 孔加100 μL 培养基和100 μL菌液，第10 孔加200 μL 培养基，设3 个重复。将孔板混匀盖好，放37℃恒温培养箱培养，24 h 后观察孔内无弥散状浑浊或孔底无沉淀的最低药物浓度即为该测试菌株对HWE 的MIC。取无菌生长孔的液体培养物100 μL 涂布于LB 琼脂平板上，37℃培养24 h，以无菌落生长的最低药物浓度为MBC。同时设立以母液为10 mg/mL 的盐酸金霉素作为阳性药物代替HWE 按照上述步骤同步测定。

2 结果与分析

2.1 HWE 的抗氧化活性

2.1.1 DPPH 自由基清除能力测定 由图2 可知，当2 种溶液浓度为0.1～0.6 mg/mL 时，VC 的DPPH自由基清除率大于HWE，当样品溶液浓度大于0.6 mg/mL 时，HWE 的DPPH 自由基清除率明显高于VC，当HWE 的浓度达到0.8 mg/mL 时，其DPPH清除率达到最高，为98%，而VC 在1 mg/mL 时DPPH 自由基清除率最高，为88.69%。

图2 HWE 及阳性对照药VC 的DPPH 自由基清除率

2.1.2 ABTS 及FRAP 抗 氧 化 能 力 测 定 图3 为HWE 和VC 分别采用ABTS 法和FRAP 法测定的总抗氧化能力结果。由ABTS 法结果可以看出，HWE和VC 的ABTS 总抗氧化能力值分别为5.44 和6.51 mmol/g，VC 的ABTS 值高于HWE；由FRAP 法结果可以看出，HWE 和VC 的FRAP 总抗氧化能力值分别为0.79 和1.47 mmol/g，VC 的FRAP 值高于HWE。总体来看，VC 的总抗氧化能力强于HWE。

图3 HWE 和VC 的FRAP 及ABTS 总抗氧化能力

2.2 HWE 的抑菌活性

2.2.1 纸片抑菌法活性测定 通过抑菌圈直径的大小可将菌种对药液的敏感程度分为高度敏感（＞20 mm）、中度敏感（14～20 mm）、低度敏感 （8～14 mm）和不敏感（＜8 mm）[20]。由表1 可知，当HWE 浓度为25 mg/mL 时，对4 种菌均表现为不敏感；当HWE的浓度为50 mg/mL 时，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌表现出低敏感；当HWE 的浓度为100 mg/mL时，对4 种菌均表现出低敏感；当HWE 浓度为200 mg/mL 时，对枯草芽孢杆菌和金黄色芽孢杆菌表现出中度敏感。总体来看，HWE 对4 种菌的敏感程度排序为金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞肠炎沙氏杆菌＞大肠杆菌，较高浓度的HWE 表现出较强的抑菌效果，但效果均差于盐酸金霉素。

表1 HWE 对4 种试验菌的抑菌圈直径

2.2.2 MIC 与MBC 活性测定 通过二倍稀释法可以得出HWE 对枯草芽孢杆菌、肠炎沙氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC 分别为12.5、6.25、3.12、12.5 mg/mL，MBC 值 分 别 为25、25、12.5、25 mg/mL。同时可以得出，盐酸金霉素对枯草芽孢杆菌、肠炎沙氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC 值均小于0.01 mg/mL，MBC 的值分别为0.04、0.04、0.04、0.02 mg/mL。

3 结论与讨论

玫瑰茄水提取物具有较强的抗氧化活性，其抗氧化能力与VC 相当，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有一定的抑菌活性，虽然抑菌效果不及盐酸金霉素，但其来源于天然植物，原材料丰富，且具有廉价、绿色、健康等优势，可将其作为饲用抗氧化剂或抑菌防霉剂进行开发利用。

试验所采用的DPPH 法与黄琼等[21]的研究一致，且结果也相似，即阳性对照VC 的DPPH 自由基清除率均低于90%，且随浓度的增加清除率无明显增加；而HWE 对DPPH 的自由基清除率当其浓度为0.8 mg/mL 时达到最高值98%。试验采用的FRAP 法和ABTS 法与王智勇等[22]和Zhang 等[11]的方法基本一致，其中2 种方法测定HWE 均表现出较强的抗氧化能力，这也与前人的研究基本一致。例如郑大恒等[23]发现玫瑰茄粗多糖对DPPH、羟基、超氧阴离子自由基具有较强的清除作用，刘雨潇等[24]发现玫瑰茄多酚含量与抗氧化能力呈量效关系。抑菌试验中所采用的微量稀释法与裴沪荣等[25]和邱亚铁等[26]的研究一致，样品均采用DMSO 助溶，其结果显示，HWE 在抑制微生物生长方面表现出一定活性，抑菌能力与浓度呈较明显的量效关系，其中HWE 对金黄色葡萄球菌的抑制效果最优，当其浓度为200 mg/mL 时，抑菌圈直径达18.83±0.58 mm；而在MIC 及MBC 指标测定中，HWE 对大肠杆菌的抑制效果表现最好，其MIC 和MBC 值分别为3.12和12.5 mg/mL。李梦淼等[27]测定了玫瑰茄醇提物的抑菌活性，发现其表现出较好的抑菌效果，并通过紫外分光光度法测定出其主要抑菌活性物质为黄酮类化合物。Borrás–linares 等[28]的研究结果表明，玫瑰茄提取物对对革兰氏阳性细菌的抑制作用更为显著。

随着“全面替抗”时代的到来，寻找天然无公害替代抗生素的添加物成为必然趋势，植物提取物型饲料添加剂是极佳的选择，也是今后饲料添加剂的主导方向。Saxena 等[29]证明了玫瑰茄提取物对不同阶段丝虫（幼虫、成虫）均具有杀灭作用，在250 mg/L 浓度下能体外杀死微丝幼，并认为将玫瑰茄开发成治疗丝虫病的有效药物具有良好的前景。玫瑰茄也被证明具有开发成天然抑菌剂的应用前景[27-30]。该研究结果表明，玫瑰茄具备开发成抗氧化剂和抑菌剂的潜力，可作为抗氧化剂及抑菌防霉剂添加到饲料中，为进一步开发利用木槿属植物提供了新思路。左苗[31]在饲料中添加一定量的玫瑰茄提取物，发现肉鸡及鲶鱼的生长性能均能得到一定的改善，这表明玫瑰茄在饲料添加剂上的开发与利用具有一定的可行性。