不同消毒措施克服设施蔬菜连作障碍的效果

肖 亮，邹湘香，刘 敏，成志军，陈 武，刘文祥

（1.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；2.湖南中烟工业有限责任公司原料保障中心，湖南长沙 410000；3.湖南省农业信息与工程研究所，湖南 长沙 410125）

湖南是我国重要的商品蔬菜生产基地之一，2019 年蔬菜种植面积超过131.32 万hm2，其中包括15.0 万hm2设施蔬菜，总产值达1 322.65 亿元[1]。在蔬菜生产中，因复种指数高、轮作困难、肥料和农药使用量大而导致的土壤理化性质恶化、土传病害高发、作物严重减产和品质下降等土壤连作障碍问题非常突出，严重影响了蔬菜的产量、品质和安全性[2-3]。采用客土换土、土壤化学熏蒸消毒、灌溉洗盐等措施虽然可以修复连作障碍，但存在成本高昂、不环保和操作流程复杂等问题[4-6]。

国家“化肥农药双减”行动，以及《“十三五”生物产业发展规划》、《农业绿色发展技术导则（2018—2030 年）》和《湖南省“十三五”科技创新规划》等系列文件明确了对突破土壤连作障碍及病虫害绿色防控关键技术的要求。为了开发适宜湖南设施蔬菜大棚的土壤绿色消毒技术，笔者以辣椒品种茄门为试材，在益阳市欣博农业有限公司连作障碍严重的设施大棚进行了多种消毒处理的比较试验，研究了不同消毒措施对土壤微生物生态、土壤微生物功能及主要土传病害（辣椒白绢病、疫霉、根结线虫和青枯病）病原菌丰度以及病害发生情况的影响，以期为解决设施蔬菜连作障碍提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试辣椒品种：茄门，由湖南省蔬菜研究所提供。于2021 年7 月18 日采用常规方法播种育苗后备用。

供试大棚：益阳市欣博农业有限公司连作障碍严重的设施大棚。该大棚已经连续种植辣椒6 a，2021 年辣椒青枯病、辣椒疫病、辣椒白绢病和根结线虫等典型根茎病害的综合发病率达85%以上，几乎绝收。

供试药剂与有机物料及其使用方法：棉隆、威百亩、用于RSD 处理的牛粪与稻壳、氰胺化钙均从当地农资市场购买。棉隆的施用与土壤处理参考行业标准NY3127—2017[7]，威百亩的土壤消毒参考团体标准T/CCPIA 055—2020[8]，RSD 处理参考王光飞等[9]的方法，氰胺化钙土壤处理参考陈利达等[10]的方法。

1.2 试验方法

土壤消毒措施共设5 个处理，分别为：T1，棉隆处理，撒施棉隆40 g/m2后翻耕，同时每小区施商品有机肥60 kg 后覆膜；T2，威百亩处理，每小区喷施威百亩30 倍稀释液5 L，施商品有机肥60 kg后覆膜；T3，氰氨化钙处理，每小区施牛粪80 kg、谷壳80 kg 和氰氨化钙12 kg，灌水至饱和后覆膜；T4，RSD 处理，每小区施牛粪100 kg、谷壳100 kg，灌水到饱和后覆膜；T5（CK）：每小区施商品有机肥60 kg，灌水至饱和，不覆膜。每个处理3 次重复，一共15 个小区，各小区面积均为80 m2，随机区组排列。土壤消毒处理始于2021 年7 月24 日，于8 月15 日完成土壤消毒后用旋耕机松土透气，然后整地。于9 月1 日按常规方法定植辣椒并进行常规管理。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 辣椒发病情况 于2021 年10 月15 日和10月29 日采用常规方法调查统计各处理的辣椒青枯病、疫病、白绢病和根结线虫等病害发病情况，并计算病情指数、发病率和防治效果。

1.3.2 辣椒农艺性状 采用常规方法调查统计各处理辣椒的株高、茎粗和产量。

1.3.3 土壤样品采集和酶活性测定 消毒处理结束后按五点式取样法采集0～10 cm 土层土壤，剔除石块和作物残体后混匀，置于自封袋带回实验室。一部分采用试剂盒法测定土壤脲酶、 -葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶的活性。另一部分经冷冻干燥后于-80℃冰箱保存备用。

1.3.4 土壤微生物群落结构和多样性分析 微生物群落结构和多样性分析时称取0.5 g 冷冻干燥后的土壤样品，用DNA 提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，MP）提取土壤总DNA。土壤总DNA 经Miseq高通量测序，分别对细菌（16S rRNA）和真菌（ITS保守区域）进行微生物群落结构和多样性分析。利用QIIME（V 1.9.1）软件过滤低质量序列并去除嵌合体。利用Uparse（V7.0）软件对样品中的有效序列以97%的一致性聚类成为OTUs，采用Mothur方法与SSUrRNA 数据库进行物种注释分析。使用QIIME（V 1.9.1）软件计算good-coverage、Chao1、Shannon、Simpson 指数等指标，并进行network 分析，以挖掘样品之间的差异。样品总DNA 提取、PCR 扩增/建库和测序等均由广东美格基因科技有限公司完成。真菌ITS2 区PCR 扩增引物为ITS2-F（5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）、ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。细菌16S rRNA V4～V5 区PCR 扩 增 引 物 为515 F（5′-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3′）、907F（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对辣椒病害防效的影响

于10 月15 日进行第1 次病害调查，发现有轻微辣椒疫病；于10 月29 日进行第2 次病害调查，CK 处理的辣椒疫病发病严重，可能由于气温不高，各处理均只有辣椒疫病发生，未观察到辣椒青枯病、白绢病和根结线虫病株。由表1 可知，辣椒疫病病情指数以CK 处理最高且显著高于其他处理，其次是T4 处理，其病情指数显著高于T1、T2 处理；各消毒处理可显著降低辣椒疫病的发生，防治效果由高到低依次为T2 ＞T1 ＞T3 ＞T4，防治效果分别为84.68%、82.89%、78.19%和67.68%。

表1 各消毒处理的辣椒疫霉病发病情况比较

2.2 不同消毒处理对辣椒农艺性状的影响

从表2 可知，各消毒处理的株高和茎粗均无明显差异，但产量差异较大，4 个消毒处理的辣椒产量均超过了1 200 kg/667m2，以T1 处理的产量最高，达1 364 kg/667m2，而CK 处理因辣椒疫病发生严重，产量仅为890 kg/667m2。由此可见，土壤消毒处理可显著降低辣椒疫病的发生，从而明显缓解因病害严重发生而导致的减产。

表2 不同消毒处理对辣椒农艺性状的影响

2.3 不同消毒处理对连作土壤酶活性的影响

土壤脲酶、 -葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶是衡量土壤物质转化能力的重要酶。从表3 可知，各处理的 -葡萄糖苷酶、蔗糖酶和脲酶活性无显著差异，酸性磷酸酶活性差异显著，以CK 处理的最高，且显著高于T1 和T2 处理，但与T3 和T4 处理差异不显著。这说明不同消毒处理对土壤酶活的影响不一致，各消毒处理对 -葡萄糖酶、蔗糖酶和脲酶活性的影响不明显，但棉隆和威百亩处理（T1 和T2）可显著降低土壤中酸性磷酸酶的活性。

表3 不同消毒处理对土壤酶活性的影响 (U/g)

2.4 威百亩消毒处理对连作土壤微生物多样性的影响

前期病害调查结果表明，威百亩消毒处理后的辣椒疫霉发病率及病情指数最低，相对防效最高。因此选取该处理与对照的土壤进行高通量测序，以比较两者之间细菌多样性的异同。经序列拼接并过滤低质量数据，高通量测序总共获得851 253 条有效的细菌reads。由图1 所示，随着测序数据量的增加，新OTU（新物种）出现的速率趋缓，说明测序量接近饱和。

图1 各组样品稀释度曲线

由表4 可知，威百亩处理土壤样品的reads 数在43 101～64 618 条之间，OTUs 数为925～2 734 个。SS1 和SS2 这2 组威百亩处理的土壤样品reads 数均大于CK 处理土壤样品，且威百亩消毒处理后土壤样品的OTUs 数均少于2 组CK 样品，说明威百亩处理降低了土壤细菌种群结构的多样性，但由于大量土壤微生物被杀灭，土壤微生物之间的互作网络被破坏，造成大量生态位点被存活的细菌所占据并大量繁殖，从而导致其丰度大幅增加（reads 数增加）。

表4 各处理土壤样品的OTUs 和reads 数

由图2 可知，威百亩消毒处理可降低土壤中细菌的多样性，从而导致物种丰富度下降（图2 左），且消毒处理和CK 处理之间的差异达极显著水平（图2 右）。

图2 细菌Alpha 多样性指数（左）及指数间差异检验结果（右）

对威百亩消毒处理后的细菌Beta 多样性进行比较分析的结果发现，结果如图3 所示，威百亩消毒处理土壤样品之间的物种组成相似，它们在PCA 图中聚集在一起，CK 处理各土壤样品间的物种组成相似度也很高（图3 左）；PCoA 分析也观察到了类似的现象，威百亩土壤消毒处理与CK 处理的细菌群落相似性在组内相似性高，但组间相似性低（图3右）。由此表明，威百亩处理重塑了土壤细菌种群结构及其多样性。

图3 细菌Beta 多样性PCA（左）及PCoA 分析（右）结果

选取威百亩消毒处理土壤中在各分类水平上平均丰度排名前15 的物种进行三元相图分析，结果见图4，威百亩消毒处理土壤中的优势细菌种群分别是硬壁菌门（Firmicutes）的芽孢杆菌目（Bacillales）（OTU910、OTU92、OTU7、OTU5、OTU4）、放 线菌门（Actinobacteria）的链霉菌属（Streptomyces）（OTU3）、变形菌门（Proteobacteria）的不动杆菌属（Acinetobacter）（OTU2）和酸杆菌门（Acidobacteria）的嗜酸杆菌纲（acidobacteriia）（OTU1）等。其中芽孢杆菌目和链霉菌属都可分泌种类丰富的抑菌活性物质及促生长物质，是公认的有益微生物；而CK 土壤中优势细菌种群主要是绿弯菌门（Chloroflexi）的纤线杆菌目（Ktedonobacterales）（OTU19）、拟杆菌纲（Bacteroidia）的Uncultured（OTU28）和奇古菌门（Thaumarchaeota） 的亚硝基菌纲（Nitrososphaeria）（OTU8）等。上述分析结果表明，芽孢杆菌和链霉菌等类群是消毒后土壤中的优势与核心细菌种群，原因可能是土壤中的芽孢杆菌和链霉菌可分别产生芽孢和孢子等休眠体，其对土壤消毒剂的耐受能力强，不易被杀灭。

图4 土壤消毒处理与CK 土壤中核心细菌物种的三元相图分析

Beta 多样性的聚类分析结果（图5）表明，以链霉菌属（OTU3）和芽孢杆菌属（OTU4、OTU5、OTU7）为代表的有益微生物的种群丰度在消毒处理前极低，但消毒处理后其相对丰度大幅提高，在SS1 组4 个样品中，链霉菌属的相对丰度比CK1组增加了43.18 倍，芽孢杆菌属的相对丰度增加了22.63 倍；在SS2 组4 个样品中，链霉菌属的相对丰度比CK2 组增加了1.23 倍，芽孢杆菌属的相对丰度增加了5.92 倍；也有大量微生物在威百亩消毒处理后相对丰度大幅下降，如酸杆菌门（OTU1）、Unassigned 和uncultured 等细菌类群的丰度分别比CK 下降了215.1%、16.2%和71.31%。

图5 2 组样品中细菌OTUS 的Beta 多样性聚类分析

选择各处理中丰度排名靠前的30 个OTUs 进行物种丰度聚类分析，结果见图6，相同处理的不同样品间细菌群落组成相似度高，但处理间的相似度低，尤其是威百亩消毒处理和CK 之间差异显著，这与三元相图和聚类分析的结果一致。

图6 不同消毒处理连作土壤的物种丰度分析

土壤细菌种群结构在4 组处理间存在较大差异，他们共有的OTU 数有1 081 个；CK1、CK2、SS1和SS2 独有的OTU 数分别有1 044、2 168、224 和380 个；另外，每2 组样品或3 组样品间还有数量不等的共有OTU（见图7）。以上分析结果同样说明了威百亩处理（T2）重塑了土壤细菌的种群结构。

图7 不同消毒处理连作土壤的细菌种群结构venn 图

土壤细菌种群结构和丰度的巨大差异必然导致微生物种群的功能属性发生相应的变化。基于16S rRNA 高通量测序的COG 功能预测分析结果（图8）表明，威百亩消毒处理和CK 的细菌群落分布特征差异明显，处理间样品高度聚集，而不同处理的离散度高；组间通路差异分析结果（图9）表明，威百亩消毒处理在新陈代谢（metabolism）和poorly characterized 这2 大类通路上明显优于CK，但在细胞过程和信号传导（cellular processes and signaling）通路上弱于CK，2 组处理在信息处理和存储（information storage and processing）通路上基本相当。

图8 基于16S rRNA 功能预测的PCA 分析

图9 基于16S rRNA 功能预测的组间通路差异分析

3 讨 论

近年来，设施蔬菜生产过程中根茎病害发生严重、土壤质量恶化和土壤盐渍化等连作障碍问题越来越严重，制约了蔬菜产业的进一步发展壮大[11-12]。虽然造成连作障碍的原因比较复杂，但在生产中最常用且有效的方法是进行土壤消毒。目前，土壤消毒方法主要有物理消毒（火焰、蒸汽、日光、高温、低温等）、化学消毒（使用各类熏蒸剂）和生物灭菌（强还原）[13-18]。通过土壤消毒可以减少土壤中的病原菌、害虫，从而显著提高设施蔬菜的产量和品质。笔者的试验结果表明，各消毒处理均可显著降低辣椒疫病的发生，防治效果由高到低依次为T2（威百亩处理）＞T1（棉隆处理）＞T3（氰氨化钙处理）＞T4（RSD 处理），防治效果分别为84.68%、82.89%、78.19%和67.68%；各消毒处理的株高和茎粗均无明显差异，但4 个消毒处理的辣椒产量均超过1 200 kg/667m2，以T1 的产量最高，达1 364 kg/667m2，而CK 因辣椒疫病发生严重，产量仅为890 kg/667m2；各消毒处理对 -葡萄糖酶、蔗糖酶和脲酶活性的影响不明显，但棉隆和威百亩处理（T1和T2）可显著降低酸性磷酸酶的活性；威百亩处理（T2）可重塑土壤微生物的种群结构，尤其是链霉菌属和芽孢杆菌属等有益微生物种群的丰度明显提高，有利于维持健康的土壤微生态环境。