橄榄苦苷通过激活AMPK信号通路缓解小鼠妊娠糖尿病＊

陈俊芳，王 霞，姚 霞，李 静，陈爱香

（1. 长治医学院附属和济医院 长治 046000；2. 长治医学院 长治 046000）

妊娠期糖尿病（GDM）表现为妊娠期不同程度的高血糖，GDM的发病率很高，是迄今为止导致新生儿和孕产妇死亡的主要原因之一[1]。GDM 的病因尚未完全阐明，以往的研究表明，胎盘分泌的激素如胎盘催乳素（HPL）、雌激素和黄体酮等对胰岛素的拮抗作用是导致GDM发病的主要原因[2]。在治疗糖尿病时，胰岛素主要用于降低血糖，但胰岛素的剂量因人而异，除了胰岛素抵抗外，还影响了其在减少母婴并发症方面的效果[3]。因此，寻找新的具有降低血糖和对抗胰岛素抵抗能力的药物，是临床上治疗GDM亟需解决的问题。

橄榄苦苷（Oleuropein，Ole）是一种类环烯醚萜，是橄榄叶、种子、果肉和未成熟橄榄果皮中最主要的酚类成分，因其抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及心脏和神经保护作用而被广泛应用于临床[4-5]。胎盘炎症和氧化应激与GDM的发生发展密切相关，两者在塑造胎儿环境中起着至关重要的作用[6]。在正常妊娠中炎症受到高度调节，这对于维持良好的胎儿发育环境至关重要。研究表明GDM 与胎盘营养转运蛋白的表达和活性失调有关，这可能源于胎盘、母亲和胎儿的炎症状态改变。先前的研究已经证明橄榄苦苷在不同的糖尿病动物模型中的功效，例如四氧嘧啶[7]诱导的和肥胖[8]诱导的糖尿病大鼠模型，使橄榄苦苷成为GDM临床治疗的潜在药物。

腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）是能量代谢的关键酶，可调节脂肪组织、肝脏和骨骼肌中葡萄糖和脂质的摄取、储存和利用[9]。已经发现抑制AMPK 信号传导与胰岛素抵抗、炎症和氧化应激相关[10-11]。AMPK还参与调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα），它们是脂肪生成的中心调节剂[12]。因此，激活AMPK的药物可能会逆转肥胖相关代谢疾病的影响，例如2型糖尿病和胰岛素抵抗[13]。先前的研究还指出AMPK 抑制和葡萄糖摄取减少之间的联系，这是导致高血糖的一个重要因素[14]。因此，AMPK激活剂已成为研发糖尿病和肥胖症等代谢疾病治疗剂的重点。鉴于AMPK在GDM中的重要作用以及橄榄苦苷在激活AMPK信号传导中的潜力，有必要对橄榄苦苷缓解GDM的作用进行全面评估。

在本研究中，旨在研究橄榄苦苷在GDM小鼠模型中的治疗作用。在有或没有橄榄苦苷治疗的GDM 小鼠中比较了GDM症状，包括增加的血糖水平、体质量、血浆胰岛素水平和肝糖原含量。通过测量肝脏氧化应激标志物来检测氧化应激水平，通过检测血清和骨骼肌中IL-6、IL-1β、TNF-α 和MCP-1 的水平来评估炎症水平。还研究了AMPK 信号通路与橄榄苦苷治疗之间的联系，以探索橄榄苦苷缓解GDM 症状的机制。该研究的结果可以深入了解橄榄苦苷缓解GDM症状的功效，并为其临床转化铺平道路。

1 材料和方法

1.1 动物实验

6-8 周龄的C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+)和C57BL/KsJ+/+(WT)小鼠购自Jackson Laboratories。喂食高脂肪饮食（17%脂肪、47%碳水化合物和29%蛋白质，Harlan Teklad）。将小鼠安置在温度为22±2℃的无菌环境中，保持12 h 光照和12 h 黑暗循环，自由获取食物和水。10-12 周龄的雌性小鼠在单独的笼子中交配，交配后的第2 天表示为妊娠天（GD0）。妊娠小鼠随机分组如下：正常妊娠对照组（WT小鼠），GDM组C57BL/KsJ Lepdb/+(db/+)，GDM+橄榄苦苷组（10 mg·kg-1·d-1，腹腔注射），正常妊娠对照组和GDM 组腹腔注射等量生理盐水。在GD15 进行腹腔葡萄糖耐量实验（GTT）和腹腔胰岛素耐量实验（ITT）测定，并检测炎症因子水平和血清葡萄糖含量。

1.2 腹腔内葡萄糖和胰岛素耐量试验

GTT 和ITT 在GD15 进行。对于GTT，在禁食6 h后以2.0 g·kg-1的剂量腹腔注射葡萄糖，使用ACCUCHEK 血糖仪（Roche Diagnostics，Switzerland）测量基线和葡萄糖注射后（注射后30、60、90 和120 min）的血糖水平。对于ITT，在禁食6 h 后以0.75 U·kg-1的剂量腹腔注射胰岛素，并在基线和胰岛素注射后（注射后30、60、90和120 min）测量血糖水平。

1.3 肝糖原含量的测量

根据制造商（BioVision，San Francisco，LA）的方案使用商业试剂盒处理肝组织，将肝裂解物与分析试剂混合后，使用酶标仪（Spectra Max 384，USA）测量肝糖原在340 nm波长处的吸光度。

1.4 血清葡萄糖和胰岛素测量

分别于GD0、9、18 使用血糖仪测量葡萄糖水平，并用超灵敏小鼠胰岛素ELISA 试剂盒（ALP CO Diagnostics，Salem，NH）分析血浆胰岛素水平。

1.5 酶联免疫吸附试验

在GD18，根据制造商的方案，使用ELISA 试剂盒测量小鼠血清IL-1β（MLB00C，R&D Systems）、IL-6（SM6000B，R&D Systems）、TNF-α（SMTA00B，R&D Systems）和MCP-1（MJE00B，R&D Systems）的水平。

1.6 实时定量聚合酶链反应

使用TRIzol 试剂（Thermo Fisher）提取细胞总RNA，根据制造商的方案，使用cDNA 逆转录试剂盒（TaKaRa Bio，China）将总RNA 逆转录为cDNA。按照RT-PCR试剂盒说明书（TaKaRa Bio，China）进行操作，以GAPDH 做为内参，每个样品设置3个复孔。引物如下：IL-6 正向5’-TGTGCTTTCTGGAGGGTCTACT-3’，反向5’-TGCCTCATCACCAACCATA AG-3’；IL-1β 正向5’-AGTAGCAGCGGTGGAAGT-3’，反向5’-CTTCC TGTATGTGCACTGGCGGTCCT-3’；TNF-α正向5’-GT CAGAAGACAAGATCACCGGA-3’，反向5’-AGGTGC ATTGATCACACCGA-3’；MCP-1正向5’-GGGTATTA GGGTTGGAATTTAATGT-3’，反向5’-CTTCCTTCTAA TTATTTCCATTTCTCTCA-3’；GAPDH正向5’-CTGG GCTACACTGAGCACC-3’，反向5’-AAGTGGTCGTTG AGGGCAATG-3’。qPCR 的反应条件设置为：95℃预变性5 min，然后进行39 个循环的95℃下变性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸60 s。采用相对表达量2-ΔΔCt的方法处理数据。

1.7 蛋白质印迹实验

从肝组织中提取蛋白质样品，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测（碧云天，上海）蛋白质浓度。进行SDSPAGE电泳，将分离的蛋白质转移至PVDF膜，使用5%的脱脂奶粉封闭1 h。TBST洗膜3次，加入相应的一抗：AMPK（ab32047，1∶1000，Abcam），p-AMPK（ab92701，1∶1000，Abcam），HDAC4（ab235583，1∶1000，Abcam），p-HDAC4（ab39408，1∶1000，Abcam），G6Pase（ab93857，1∶1000，Abcam），β-actin（ab8226，1∶1000，Abcam），在4℃孵育过夜。TBST 洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育1 h。ECL 底物化学发光显色后用Image J软件进行条带分析。实验重复3次。

1.8 统计学分析

结果以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 20.0软件进行数据分析，两组之间的比较通过t检验进行分析，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），然后进行Tukey 事后检验，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 橄榄苦苷可以改善GDM小鼠的糖尿病症状

首先，评估橄榄苦苷对整个妊娠期GDM小鼠体质量和血糖水平的影响。如图1A 所示，3 组小鼠在怀孕期间体质量均有所增加。GD18，橄榄苦苷治疗的GDM 小鼠的体质量明显低于GDM 组小鼠，表明橄榄苦苷治疗阻止了GDM 小鼠体质量的增加。相应地，GDM 小鼠从GD0 到GD18 的体质量增加显著高于正常组小鼠（图1B）。正常妊娠小鼠的血清葡萄糖水平在GD0、9 和18 保持稳定。与正常组小鼠相比，GDM小鼠在GD0、9和18的血糖水平显著升高，橄榄苦苷治疗显著降低了GDM 小鼠GD9、18的血糖水平（图1C）。数据表明橄榄苦苷改善了GDM小鼠的糖尿病症状。

图1 橄榄苦苷对GDM小鼠的糖尿病症状的影响（n=5）

2.2 橄榄苦苷可以改善GDM 小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性

检测橄榄苦苷对GDM 小鼠葡萄糖和胰岛素耐受性的影响。在葡萄糖注射前，与正常组小鼠相比，GDM 小鼠的血糖水平显著升高，橄榄苦苷治疗组小鼠血糖水平较GDM 组显著下降。注射葡萄糖后，3 小鼠血糖均升高。在葡萄糖注射后的所有4 时间点（30、60、90 和120 min），GDM 组小鼠的血糖水平均显著高于正常组小鼠，并且橄榄苦苷显著降低了GDM小鼠的血糖水平（图2A）。相应地，GDM 小鼠的葡萄糖曲线下面积（AUC）明显大于正常组小鼠，橄榄苦苷治疗组小鼠的AUC 显著小于GDM 组小鼠。因此，数据表明橄榄苦苷改善了GDM 小鼠的葡萄糖耐量。如图2B所示，注射胰岛素导致所有小鼠的血糖水平降低。GDM组小鼠在注射胰岛素后30、60、90和120 min的血糖水平显著高于正常组小鼠，橄榄苦苷治疗在所有4时间点都显著降低了GDM小鼠的血糖水平。相应地，橄榄苦苷治疗组小鼠的AUC 显著低于GDM 小鼠。表明橄榄苦苷改善了GDM小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性。

图2 橄榄苦苷对GDM小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性的影响（n=5）

2.3 橄榄苦苷抑制GDM小鼠的炎症

为评估橄榄苦苷对GDM小鼠炎症的影响，首先监测了血清中炎症细胞因子的水平。与正常组小鼠相比，GDM 小鼠的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和MCP-1水平都显著升高。与GDM组小鼠相比，橄榄苦苷治疗组小鼠血清中这些炎症因子的水平显著降低（图3A-3D）。在骨骼肌中也得到了相同的结果（图3E）。表明橄榄苦苷可以抑制GDM小鼠的炎症。

图3 橄榄苦苷对GDM小鼠炎症的影响（n=5）

2.4 橄榄苦苷促进肝脏中AMPK活化

为了研究橄榄苦苷治疗GDM 的潜在机制，在GD18 时取小鼠肝脏组织，通过Western blot 检测橄榄苦苷对AMPK 信号通路的影响。结果发现与正常组小鼠相比，GDM 组小鼠的AMPK 活化受到抑制，而橄榄苦苷显著恢复了p-AMPK 的表达。组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）是糖代谢中的关键酶，发现在GDM 小鼠中，HDAC4 激活和G6Pase 表达水平上调，而橄榄苦苷治疗可以逆转AMPK 相关蛋白的激活模式，降低G6Pase 的表达，见图4。表明橄榄苦苷对GDM 小鼠的治疗作用可能是通过激活AMPK信号通路介导的。

图4 橄榄苦苷对AMPK信号通路的影响（n=5）

2.5 橄榄苦苷改善GD小鼠的生殖结果

为了解橄榄苦苷对妊娠结局的影响，检查了各组小鼠的产仔数和出生体质量。结果发现橄榄苦苷显著恢复了GDM 组小鼠增加的出生体质量（图5A）和减少的产仔数（图5B），表明橄榄苦苷的抗炎和抗氧化作用转化为GDM小鼠妊娠结局的改善。

3 讨论

GDM 是妊娠期间由胰岛素抵抗和胰腺β 细胞功能障碍引起的一种暂时性葡萄糖不耐受形式，是最常见的妊娠并发症之一，与孕产妇和新生儿结局风险的显著增加有关，GDM 女性的后代更有可能患上糖尿病和代谢综合征[15]。目前治疗GDM 的方案十分有限，胰岛素是主要的治疗方法，但会导致低血糖的发生，并且和不良的胎盘、胎儿和母体结局相关[16]。虽然二甲双胍能有效治疗GDM，但它可以穿过胎盘，对胎儿的长期影响未知[17]。因此，迫切需要寻找能有效治疗GDM且副作用小的药物。

橄榄苦苷是橄榄果实、叶子、树枝和油中最活跃的酚类化合物之一，具有多种生物学功能。由于橄榄苦苷在临床前和临床研究中对葡萄糖稳态的有益作用，越来越多的研究集中在橄榄苦苷的抗糖尿病功能上[18]。在本研究中，使用GDM 小鼠模型评估橄榄苦苷对GDM症状（母体体质量和血糖）、葡萄糖和胰岛素耐量的治疗作用。结果证明橄榄苦苷通过显著降低体质量和血糖水平来缓解GDM小鼠的症状，并且改善了葡萄糖和胰岛素耐受性。此外，橄榄苦苷还通过降低出生体质量和增加产仔数来改善GDM 小鼠的生殖结局。这些结果展现出了橄榄苦苷对GDM的保护作用，表明橄榄苦苷可能作为治疗GDM的潜在药物。

炎症和氧化应激与母体胰岛素抵抗的增加有关，是导致GDM 发病的两个主要因素[19]，研究发现橄榄苦苷能够恢复升高的炎症反应和氧化应激水平。怀孕期间炎症反应和氧化应激的失调可能是孕妇激素水平和能量代谢改变的结果[20]，增加的激素产生可以促进脂肪分解，进而导致炎症因子分泌、脂质代谢和葡萄糖代谢异常以及胰岛素抵抗，并且失调的蛋白质和脂质氧化也可能导致过度的氧化应激，从而进一步破坏胎儿发育环境[21]。TNF-α是炎症反应中最早的细胞因子之一，被认为是胰岛素抵抗的预测因子[22]。此外，TNF-α作为起始因子并激活IL-6的分泌，IL-6是炎症反应中重要的促炎因子，GDM 患者处于慢性炎症状态，血清中IL-6和TNF-α等炎症因子水平显著高于正常妊娠[23]。在目前的研究中，证实GDM 小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平显著升高，橄榄苦苷治疗后，GDM 小鼠肝脏中的氧化应激水平，以及血清和骨骼肌中的炎症水平都显著降低。许多研究描述了TNF-α 在胰岛素抵抗的病理生理学中的直接作用[24]。与先前的研究结果一致，证明骨骼肌中TNF-α 的产生增加导致GDM小鼠的胰岛素敏感性降低，而橄榄苦苷抑制TNF-α 的产生并改善GDM 小鼠的胰岛素敏感性。总之，这些数据证实了橄榄苦苷的抗氧化和抗炎效力，以及在GDM小鼠中的治疗作用。

AMPK 是调节葡萄糖代谢的关键代谢酶，运动和离体收缩可以激活AMPK 并刺激骨骼肌吸收葡萄糖，已有多项研究表明激活AMPK 通路可以增加胰岛素敏感性，从而改善糖尿病症状[25-26]。为了探索橄榄苦苷治疗GDM 的分子机制，重点研究了AMPK 信号通路。研究结果表明GDM 小鼠的AMPK 活化受损，这可能导致GDM 小鼠胰岛素抵抗。橄榄苦苷治疗增加了AMPK 活化，进而导致葡萄糖摄取增加和胰岛素抵抗降低，这也与前人的研究结果相符合[27]。以前的研究建立了两种橄榄苦苷降血糖的可能作用机制：①改善葡萄糖诱导的胰岛素释放；②增强外周葡萄糖摄取[28]。已经观察到橄榄苦苷可以加速细胞对葡萄糖的摄取，从而导致血浆葡萄糖降低。AMPK信号传导与葡萄糖的摄取相关[14]，这也解释了橄榄苦苷增强细胞对葡萄糖摄取的原因。AMPK 信号抑制也与胰岛素抵抗、炎症和氧化应激有关。研究结果表明橄榄苦苷可以通过激活AMPK 信号通路改善GDM 小鼠症状，降低血糖和炎症水平，并且改善小鼠妊娠结局，正如GDM 小鼠产仔数增加和出生体质量降低所示。此外，还需要在细胞水平上研究橄榄苦苷对胰岛的影响，以更深入地了解橄榄苦苷治疗GDM的机制。

总之，本研究报告了使用植物提取物橄榄苦苷治疗GDM，结果表明橄榄苦苷可以缓解GDM 小鼠症状，恢复血清葡萄糖水平和胰岛素敏感性，还能降低炎症反应和氧化应激，改善妊娠结局，还证明橄榄苦苷可能通过激活AMPK信号通路发挥其治疗作用。