当归红芪超滤物通过抑制心脏CILP1过表达对放射性心肌纤维化的干预效应＊

赵晓彬，蒋虎刚，王新强，韩金晏，陈玉林，李应东，2，3，赵信科

（1. 甘肃中医药大学中西医结合学院 兰州 730000；2. 甘肃中医药大学附属医院 兰州 730000；3. 甘肃省中医药防治慢性疾病重点实验室 兰州 730000）

心肌纤维化是多种心血管疾病末期常见的病理表现，成纤维细胞积累增加和细胞外基质产生和降解失衡是其主要的特征，而心肌纤维化是各种心脏病进展的一个重要因素[1-2]。软骨中间层蛋白1（Cartilage intermediate layer protein 1，CILP1）是一种由软骨细胞分泌的基质蛋白，与常见的肌肉骨骼类疾病相关。既往有研究发现[3]，CILP1在心衰患者及心衰模型小鼠的心脏中均有表达，并且可以调控主动脉缩窄术后小鼠的心肌纤维化，研究发现[4]，CILP1 可能是病理性心脏重构的生物标志物，并可通过促进肌成纤维细胞增殖和心肌纤维化加重病理性心脏重构，而在CILP1 敲除后的模型小鼠中发现，其心脏中炎症因子表达减少，肌成纤维细胞减少，微血管存活率提高[5]。TGF-β1/Smad3 信号通路是调节心肌纤维化的经典通路，TGFβ1可调控心肌细胞分泌多种细胞外基质、下调基质金属蛋白酶9 等的表达从而促进心肌纤维化的发生[6-7]。研究发现，心脏组织中IL-1β、TNF-α 等炎症因子是TGF-β1/Smad3 信号通路的上游信号，可直接参与TGF-β1/Smad3 信号通路的激活[8]。本研究推测，心肌细胞CILP1 过表达可通过诱导炎症反应激活TGF-β1/Smad3信号通路是放射性心肌纤维化的潜在机制。本课题组前期研究证实[9-10]，当归红芪超滤物（Radix Angelica Sinensis and Radix Hedysari ultrafiltration，RAS-RH）能够明显减轻辐射诱导的心肌炎症反应、抑制心肌细胞凋亡、减少心肌胶原纤维沉积等，从而有效抑制放射性心肌纤维化的发生，而RAS-RH 是否通过下调心脏中CILP1的表达延缓心肌纤维化的发生尚不明确。本研究旨在明确CILP1过表达在心肌纤维化发生中的调控作用及RAS-RH 对辐射后心脏中CILP1过表达干预作用，为心肌纤维化的防治提供新的思路。

1 材料

1.1 实验动物

健康Wistar 雄性大鼠40 只，8 周龄，SPF 级，体质量200±20 g，购于甘肃中医药大学动物实验中心（动物许可证：SYXK(甘)2021-0006）。实验伦理号：2018-033。

1.2 药物

RAS-RH，当归和红芪饮片购自甘肃中天药业有限责任公司，经由甘肃中医药大学附属医院中药师鉴定后，将当归和红芪按1:5 比例混合，加5 倍体积水煎煮1 h，滤渣，收取煎煮液后，将滤渣再次煎煮。将两次收集的煎煮液再次煎煮浓缩，制成约1 g·mL-1药物浓度，送甘肃膜科学技术研究所采用截留分子量为100 kDa 超滤膜滤过（技术参数为压力0.5 kPa·m-3，流量100 L·h-1·m-2，温度25℃），并将超滤液制成干燥粉末。本研究所用RAS-RH，由本课题组前期制备所得，生产批号：20190619。

盐酸贝那普利，生产批号：20181114，规格：5 mg/片，由深圳信立泰药业股份有限公司生产。

1.3 实验仪器和试剂

Eppendorf 移液枪、Multiskan FC 酶标仪（美国Thermo 公司），精密电子天平（OHAUS 公司），高速冷冻离心机（美国Sigma 公司），Titan 电镜（日本奥林巴斯），X-ray 辐射仪（美国Faxitron 公司），JB-P5 型组织包埋机（俊杰电子有限公司），RM2016 型病理切片机（上海莱卡仪器有限公司），KD-P 型组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；载玻片及盖玻片均购于江苏世泰实验器材有限公司，BX43+sc50 显微拍照系统（奥林巴斯有限公司）。

苏木素染液、伊红染液购自北京益利精细化学品有限公司，批号分别为：20210078，20210175；N 端B 型利钠肽（NT-pro BNP)ELISA试剂盒，武汉菲恩生物科技有限公司，生产批号ER0906；肌钙蛋白Ⅰ（CTnⅠ）、肌钙蛋白T（CTnT）ELISA试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司，生产批号分别为：56439781、39564178）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、转化生长因子-β1（TGF-β1）抗体（美国Immunoway 公司，货号分别为YM3378、YM6365）；软骨中间层蛋白1（CILP1）抗体、Smad3 抗体（Abcam 公司，货号分别为：ab17293、ab40791）；Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）抗体、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）抗体（美国Affinity 公司，货号分别为AF7075，AF0189）；GAPDH 抗体，美国ImmunoWay 公司，批号：Lot：B1787。

2 方法

2.1 分组与造模

将SPF 级8周龄40只Wistar雄性大鼠适应性饲养1 周后，随机分为正常组、模型组、盐酸贝那普利组、RAS-RH 组、盐酸贝那普利+RAS-RH 组，每组8 只，除正常组外，模型组、盐酸贝那普利组、RAS-RH 组、盐酸贝那普利+RAS-RH 组大鼠参照国内外实验研究造模[11]，造模以1%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔内注射麻醉大鼠，麻醉后定位大鼠心脏，置于X-ray 辐射仪下，使用6 MV 高能X 射线，以2 cm×2 cm 为辐射视野、1.5 cm 为照射深度，源皮距100 mm，前后对穿照射，吸收剂量率300 cGy·min-1射线照射心脏，其余部位由铅板遮挡。大鼠心脏接受18 Gy 剂量的照射相当于通常用于患者分次照射2 Gy×30 次的效果[12]，辐照结束后将大鼠分笼放置，等待苏醒，待大鼠苏醒后，对各组大鼠行灌胃处理。

2.2 药物干预

本课题组前期研究表明RAS-RH 以0.6 g·kg-1[13]干预疗效确切，因此以该剂量进行后续研究。正常组与模型组给予生理盐水溶液灌胃，盐酸贝那普利组给予盐酸贝那普利1.0 mg·kg-1；RAS-RH 组给予RASRH 0.6 g·kg-1；盐酸贝那普利+RAS-RH 组给予盐酸贝那普利1.0 mg·kg-1与RAS-RH 0.6 g·kg-1，并用生理盐水配制药物，配制好后每组按同等体积生理盐水灌胃，干预4 周，干预期间各组大鼠均给予SPF 级大鼠维持饲料饲养。

2.3 ELISA 检测各组大鼠血清中NT-proBNP、CTnⅠ、CTnT的含量

实验结束后将各组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻醉，腹主动脉采血后，低温离心，分离血清，-80℃冰箱保存，使用Elisa 试剂盒检测大鼠血清中NT-ProBNP、CTnⅠ、CTnT 的含量水平，实验步骤严格按照说明书进行。

2.4 HE染色观察各组大鼠心肌组织病理学变化

采血后处死大鼠，取大鼠心肌组织固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋后制备5 μm 石蜡切片，烤片后进行脱蜡至水，进行心肌组织HE 染色，镜下评价心肌组织形态学改变。

2.5 Masson染色评价各组大鼠心肌胶原沉积情况

大鼠心肌组织固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋切片，脱水，苏木素染色5-10 min，酸性乙醇分化10 s、蒸馏水漂洗、酸性丽春红品红染色5-10 min 后，水溶液分化3-5 min，苯胺蓝染色2 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明3 次，封片。应用Image-Pro 6.0 图像分析软件系统分析大鼠心肌组织的胶原容积分数（Collagen volume fraction，CVF），CVF=视野内心肌胶原面积/视野总面积，最后取平均值。

2.6 免疫组化检测各组大鼠心肌组中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表达水平

大鼠心肌组织固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋后制备5 μm 切片，切片经二甲苯脱蜡至水，EDTA 修复抗原及山羊血清封闭处理后，分别滴加抗大鼠Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA 抗体过夜，次日，充分洗片后滴加HRP-标记二抗，室温孵育30 min，洗片后DAB 显色，采用苏木素复染，封片，电子显微镜观察并拍照，采用Image J-Pro Plus 6.0 图像分析软件分析阳性信号A值，以A值代表目的蛋白表达水平。

2.7 Western blot法检测各组大鼠心肌组织中TGF-β1、smad3、CILP1蛋白表达

将大鼠心肌组织置于匀浆管中剪碎、研磨、离心，收集上清液保存备用，用BCA 蛋白定量试剂盒定量，上样缓冲液配平，95℃金属浴混合液体15 min，再次短暂离心，-20℃分装备用；SDS-PAGE 电泳分离，灌胶，上样，电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗TGF-β1、smad3、CILP1、GAPDH（1:1000）4℃孵育过夜，清洗，二抗HRP（1:3000）室温孵育30 min，洗膜3 次，每次15 min，发光并采图保存。使用Image J 测定目的条带与内参GAPDH灰度值比值表示所测蛋白的表达水平。

2.8 统计分析

数据运用SPSS 24.0软件进行分析，对计量资料进行正态性检验，若符合正态分布，则采用均值±标准差（±s）表示，若两组间比较满足正态分布及方差齐性用t检验，不满足正态分布及方差齐性用秩和检验，多组间比较用单因素方差分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血清中NT-proBNP、CTnI、CTnT的表达

与正常组比较，模型组大鼠血清中的NTproBNP、CTnI、CTnT 水平升高（P<0.05）；与模型组相比，盐酸贝那普利组、RAS-RH 组、盐酸贝那普利+RAS-RH 组中的NT-proBNP、CTnI、CTnT 的表达水平降低，盐酸贝那普利+RAS-RH 组具有显著意义（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清NT-proBNP、CTnI、CTnT的表达情况（n=8）

3.2 HE染色结果

HE 染色可见，正常组心肌组织结构完整，心肌排列整齐，纤维及断面排列整齐；模型组肌纤维排列紊乱，心肌组织可见炎性细胞浸润，有出血、心肌纤维形态改变、纤维化程度较重，盐酸贝那普利组、RAS-RH组、盐酸贝那普利+RAS-RH 组相对于模型组有所改善，且盐酸贝那普利+RAS-RH 组恢复程度优于盐酸贝那普利组、RAS-RH 组。RAS-RH 组部分纤维排列紊乱间隙较大，见图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态学评价（40×）

3.3 Masson染色结果

Masson 染色可见，正常组大鼠红色心肌组织排列整齐，间质内少见蓝染胶原纤维组织；与正常组相比，模型组大鼠心肌组织中蓝染胶原纤维组织明显增加，心肌排列紊乱，胶原沉积增加，CVF 显著升高（P<0.01）；与模型组相比，盐酸贝那普利组、RAS-RH 组可见少量蓝染胶原纤维、胶原沉积显著减少，CVF 显著降低（P<0.01），而盐酸贝那普利+RAS-RH组肌纤维间隙较正常组稍宽，CVF 较模型组明显减少（P<0.01）。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织胶原纤维评价结果（40×）

3.4 各组大鼠心肌组织中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达水平变化

与正常组比较，模型组大鼠心肌组织中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组比较，盐酸贝那普利组、RAS-RH 组与盐酸贝那普利+RAS-RH 组α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达明显降低，盐酸贝那普利+RAS-RH 组具有显著意义（P<0.05），见图3、4。

图3 各组大鼠心肌组织α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达检测结果（20×）

图4 各组大鼠心肌组织中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达的结果

3.5 各组大鼠心脏组织TGF-β1、smad3、CILP1 蛋白表达结果

与正常组比较，模型组大鼠心肌组织TGF-β1、smad3、CILP1 蛋白表达显著升高（P<0.01）。与模型组比较，盐酸贝那普利组、RAS-RH组与盐酸贝那普利+RAS-RH 组TGF-β1、smad3、CILP1 蛋白表达明显降低，盐酸贝那普利+RAS-RH 组具有显著意义（P<0.01）。见图5。

图5 各组大鼠心肌组织中TGF-β1、smad3、CILP1蛋白表达检测结果

4 讨论

心肌纤维化是受损的正常心肌组织被纤维化组织替代，使心肌组织丧失其正常的结构与功能，引起心肌重塑的重要病理过程[14]。其机制主要与心肌细胞外基质中的胶原过度沉积导致间质增生、炎性细胞浸润、肌纤维排列紊乱、断裂有关[15]。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，当发生心肌纤维化时，会伴随胶原纤维网的形成，致使心肌收缩功能发生障碍，从而影响心功能，而随着心肌纤维化的发生与发展，最终可能会导致心力衰竭、各种心律失常等心脏疾病的发生[16-17]。近年来西医在抗心肌纤维化的治疗主要以RASS 抑制剂、他汀类、钙通道阻滞剂为主，但在临床应用中具有局限性。研究表明，中医具有改善患者心功能及提高生存率等诸多优势，因此探索中医药防治心肌纤维化的作用机制，对防治心肌纤维化有着重要的现实意义。

祖国医学将心肌纤维化归属“胸痹”、“心悸”等范畴。“本虚标实”为其基本病机特点，本虚以气血亏虚为主，标实以血脉瘀阻为主，治疗以“益气补血活血”为治则。气为血之帅，血为气之母，气虚则气化失司、无力推动血液运行，故血瘀内阻；血虚，则脏腑失于濡养，脏腑功能紊乱，气之生成不足，故正气亏虚，无力驱邪外出，久病入络则脉络瘀阻。RAS-RH 是本课题组依据当归补血汤比例将当归、红芪配伍制备而成，前期研究亦发现[18-19]，其可通过抑制炎症反应、抗氧化应激、抑制细胞凋亡等多种机制对放射性心脏病大鼠模型心脏损伤具有改善作用。

当心脏受到多种病理因素刺激时会生成大量的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ胶原蛋白，而胶原蛋白作为细胞外基质主要成分，其过度沉积会导致间质增生，炎性细胞浸润，心肌纤维排列紊乱、断裂，导致间质纤维化，从而引起心脏功能障碍。本研究通过HE染色与Masson染色观察心肌组织形态学改变发现与正常相大鼠比较，心肌组织可见大量的炎性细胞浸润，心肌间质可见大量蓝色纤维化组织，有出血、心肌细胞排列紊乱，尤其是血管周围明显。而经过RAS-RH 干预后，大鼠心肌纤维组织明显减少，排列紊乱改善。而通过免疫组化观察显示，与正常组相比，模型组大鼠心肌组织中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达增加，并大片分布于细胞外基质，且形态不规则，而经RAS-RH 干预后，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达明显减少，排列也较为整齐。另外，通过检测大鼠血清中心肌细胞损伤标志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 的含量发现，与正常组相比，模型组大鼠血清内心肌细胞损伤标志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 明显升高，而经RAS-RH 干预，RAS-RH 组大鼠大鼠血清内心肌细胞损伤标志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 明显降低，以上结果提示RAS-RH 可通过“益气养血”的作用来改善辐射引起的心脏结构功能结构紊乱。

CILP1作为一种在关节软骨中大量存在的细胞外基质蛋白，相关研究发现，心肌组织中存在大量的CILP1[20]，而心肌成纤维细胞是CILP1 的主要来源，与细胞外基质重塑和TGFβ1 信号传导密切相关[21]，并且在心肌病模型中升高，这提示CILP1 是心脏纤维化的敏感标志物，可作为治疗心肌纤维化的新靶点。此外还有研究显示[22]，CILP1 过表达可诱发大量的炎性细胞聚集、浸润，而机体内炎症因子水平明显升高与增加会进一步引发心肌细胞损伤。本研究发现，X 线辐射后模型组大鼠心肌组织CILP1 蛋白表达明显升高且心肌纤维形态改变、胶原沉积显著增加，提示CILP1可能是调控心肌细胞损伤的关键靶点之一。TGF-β作为调节细胞生长、增殖、分化等的重要细胞因子，介导心肌纤维化病理生理过程。而TGF-β1 为TGF-β超家族关键致纤维化细胞因子，其可刺激心肌成纤维细胞增殖，造成细胞外基质和纤维过度沉积，从而推动心肌纤维化的形成和发展。此外，Smad3 作为TGF-β 信号通路的拮抗剂，其发生磷酸化后并易位入核后将会启动TGF-β1 靶基因的转录，使TGF-β1/Smad 信号传导通路被激活，从而诱导心肌成纤维细胞的增殖、胶原蛋白等细胞外基质合成和过度沉积，诱发心肌纤维化的发生。本研究发现，X 线辐射后心肌组织内TGF-β1、Smad3、CILP1 表达明显升高，而CILP1 可靶向调控TGFβ1 信号传导参与心肌纤维化的调控，而给予RAS-RH 后TGF-β1、Smad3、CILP1 表达降低，提示RAS-RH 抑制心肌纤维化的作用可能与降低CILP1 高表达抑制炎症反应诱导TGF-β1/Smad3信号通路激活有关。α-SMA 作为TGF-β1/Smad 信号通路的下游信号分子之一，TGF-β1/Smad3 信号通路激活可引起α-SMA 表达升高，而α-SMA 的表达升高，将会增加细胞外基质Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白合成。研究还发现，模型组中α-SMA 表达明显增高，提示CILP1 还可能通过激活TGF-β1/Smad3 信号通路，诱导α-SMA 表达升高，而增加Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的合成。

本研究认为，X 线辐射诱导心肌细胞损伤的发生属于中医“气虚血瘀”病机，而采用具有“益气养血活血”功效的RAS-RH 干预后，心肌细胞损伤标志物NT-proBNP、CTnI、CTnT 的含量明显降低，提示RASRH 可通过“益气养血”的作用来改善辐射引起的心肌组织气血失和，脏腑功能结构紊乱。而X 线辐射后CILP1 高表达可通过介导炎症反应激活TGF-β1/Smad3 信号通路进一步引发胶原沉积显著增加、肌纤维排列紊乱、心肌纤维形态改变，而肌纤维排列紊乱、心肌纤维形态改变，胶原沉积显著增加属中医“气虚血瘀”范畴，气虚推动乏力，无力驱邪外出，久病入络则脉络瘀阻，则导致心肌组织各种代谢活动减弱，而采用具有“益气养血活血”功效的RAS-RH 干预后心肌组织中的CILP1、TGF-β1、Smad3 表达下调，同时心肌组织中胶原沉积明显减轻，心肌纤维程度明前减轻，提示RAS-RH具有“益气活血”作用。

综上所述：RAS-RH 可通过抑制心脏CILP1 的表达对X 线辐射后大鼠心肌纤维化具有一定的改善作用，其中医学内在机制可能与RAS-RH 益气补血活血的功效相关。