局部应用傅山风湿外治方对胶原诱导性关节炎大鼠炎性细胞因子和Notch2通路的影响＊

高玉亭，李 振，赵彩虹，赵雨薇，王 泽，郝慧琴

（山西中医药大学基础医学院 晋中 030619）

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是炎症、肿胀和关节破坏，主要影响外周关节[1]。治疗RA 的传统药物主要有非甾体抗炎药和改善病情的抗风湿药物等。目前用于治疗RA 的药物价格昂贵，并且经常对患者的健康造成不利影响，迫切需要通过更加安全、有效和廉价的治疗方法应用于RA 治疗，而针对RA 炎症的局部应用药物是潜在的治疗方法[2]。中医药在RA 治疗中具有巨大的潜力，局部使用中药膏剂用于治疗关节炎等肌肉骨骼损伤和疼痛有着悠久的历史并广泛应用于临床[3-4]。

傅山风湿外治方来源于清代山西名医傅山《大小诸证方论》，由牛皮胶、天南星、生姜、羌活、乳香和没药6 味药组成，具有祛风胜湿、散寒止痛、活血消肿等功效，局部应用于治疗“痹证”[5]。课题组前期研究结果显示，傅山风湿外治方对RA 的治疗作用可能与抑制Notch1/Jagged1 通路激活，调节Th1/Th2 细胞因子平衡有关[6]，但其对Notch2/DLL1 通路的影响尚不明确。Notch2 调控破骨细胞生成介导RA 骨破坏，而RA 以慢性炎症和关节破坏为主要特征，因此，本研究探讨局部应用傅山风湿外治方对胶原诱导性关节炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠炎性细胞因子和Notch2 表达的影响，以期为局部应用傅山风湿外治方治疗RA提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

1.2 傅山风湿外治方外治方的制备

黄明胶（Cat. No.1812001）购自东阿阿胶股份有限公司，天南星（Cat. No.180101）和羌活（Cat. No.181101）购自山西元和堂中药有限公司，乳香（Cat.No.18180405402）购自河北百合中药饮片有限公司，没药（Cat. No.465180701）购自安国市远元药业有限公司，经鉴定质量符合国家药典标准。将以上药物冷冻干燥后分别使用粉碎机粉碎30 s，过80目筛后按4∶1∶1∶1∶1比例混合。生姜购自当地农贸市场，经鉴定质量符合国家药典标准，清洗后在搅拌机中磨碎，3000 r·min-1离心20 min，取上清。将获得的生姜汁加入前述混合物中，85℃下以300 r·min-1转速搅拌20 min，常温下继续搅拌至冷却得到膏剂，浓度为1 g·mL-1

1.3 主要试剂与仪器

牛Ⅱ型胶原（Cat. No. 20022）购自美国Chondrex公司；完全/不完全弗氏佐剂（Cat. No. F5881、F5506）购自美国Sigma 公司；肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）和干扰素-γ（Interferon- γ，IFN- γ）ELISA 试剂盒（Cat. No.E02T0008, E02I0006, E02I0309, E02I0345）购自上海蓝基生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒（Cat. No.9108）、反转录试剂盒（Cat. No. RR047A）和荧光定量试剂盒（Cat. No. 639676）购自宝生物工程（大连）有限公司；Notch2 抗体（Cat. No. bs-21664R）、核因子-κBp65（nuclear factor-κBp65，NF-κBp65）抗体（Cat.No. Bioss bs-0465R）购自北京博奥森生物技术有限公司，Delta-like 配体蛋白1（delta-like ligand protein-1，DLL1）抗体（Cat. No. A14277）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，GAPDH 抗体（Cat. No. ab181602）购自Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗（Cat. No. SE134）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Cat. No.PC0020）、ECL 显色液（Cat. No. PE0010）购自北京索莱宝科技有限公司。天冬氨酸转氨酶（Aspartate transaminase，AST）、丙氨酸转氨酶（Alanine transaminase，ALT）、血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（Creatinine，Cr）测定试剂盒（Cat. No.C010-2-1、C009-2-1、C013-2-1、C011-2-1）购自南京建成生物工程研究所。

正置显微镜购自德国徕卡公司，酶标仪购自美国赛默飞公司，高速冷冻离心机购自德国Eppendorf股份公司，荧光定量PCR 仪购自新加坡Life Technologie 公司；化学发光成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.4 CIA大鼠模型构建、分组和给药

采用随机数字表法将36 只大鼠随机分为正常组10 只和造模组26 只。CIA 大鼠模型构建参考已有方法进行[7]，简而言之，按1∶1 将牛Ⅱ型胶原溶液和完全弗氏佐剂混合并乳化，按每只5 mL在大鼠尾跟和背部进行多点皮下注射。第7 天，将弗氏完全佐剂替换成不完全弗氏佐剂，按每只0.3 mL 腹腔注射进行加强免疫。第14天，对造模组大鼠进行关节炎指数评分[8]，评分≥4分则判定为造模成功用于后续实验[9]。将造模成功的20 只大鼠按随机数字表法平均分为模型组和傅山风湿外治方组各10 只。第14 天，将0.4 mL（根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算）傅山风湿外治方药膏均匀涂抹于大鼠踝关节，覆盖纱布并使用塑料薄膜固定以防止被大鼠舔食。正常组和模型组给予等体积生理盐水局部涂抹。每天更新2次，连续使用42天。

1.5 标本采集

第56天，大鼠禁食过夜，3%戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，腹主动脉取血，3000 r·min-1离心10 min，收集血清。取左踝关节滑膜组织液氮冻存，右踝关节、肝和肾组织4%多聚甲醛固定，取脾脏冻存。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 关节炎指数评分

2.4 王屋镇各树种的保护级别 王屋镇古树名木一级古树21株，所占比例为22.3%；二级古树48株，所占比例为51.1%；三级古树25株，所占比例为26.6%(表4)。

第14天开始每周进行关节炎指数评分，评分于给药前实施。由非实验参与人员通过视觉检查大鼠四肢关节的肿胀程度评估关节炎的严重程度。评分标准[8]为：0分：无关节红肿；1分：踝关节或足趾的轻度红肿；2 分：踝关节的中度红肿；3 分：包括趾关节在内的全足明显红肿；4 分：全足明显红肿伴关节变形、功能障碍。评分最高为16分。

1.6.2 HE 染色检测大鼠踝关节、肝和肾组织病理学变化

4%多聚甲醛固定大鼠踝关节（10% EDTA 脱钙5 周）、肝和肾组织，脱水透明后石蜡包埋，切成4 μm薄片，将切片进行HE 染色，中性树胶封片，显微镜下观察病理学变化。采用盲法对踝关节H&E 染色进行病理学评分，评分标准[10]为：0 分：正常踝关节；1 分：正常滑膜，偶见单核细胞；2分：明确关节炎，滑膜衬里细胞几层扁圆形，单个核细胞散在分布，单核细胞密集浸润；3分：滑膜明显增生，3层以上内衬细胞层排列松散，单核细胞密集浸润；4分：严重滑膜炎伴血管增生，关节软骨及软骨下骨质侵蚀。

1.6.3 ELISA 检测大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ水平变化

分别设置空白对照孔、标准孔和待测样本孔，分别加入100 μL样品。在各孔中加入酶标记溶液50 μL，密封后37℃孵育反应1 h。各孔依次加入显色剂A、B 50 μL，25℃避光反应10 min，加入终止液50 μL，使用酶标仪检测450 nm 波长处光密度值，根据标准曲线计算大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 浓度。实验重复3次，取平均值。

1.6.4 qRT-PCR 检测大鼠踝关节滑膜和脾脏组织Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表达水平变化

使用Primer Premier 5.0 软件分别设计Notch2、DLL1、NF-κBp65和β-actin基因引物并合成（表1）。提取大鼠踝关节滑膜组织和脾脏总RNA 并检测其浓度和纯度，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，反转录条件37℃ 15 min，85℃ 5 s。qRT-PCR 检测Notch2、DLL1、NF-κBp65mRNA 水平，20 μL 反应体系包括qPCR 预混液Mix 10 μL、正反向引物各0.5 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.0 μL，反应程序：95℃ 10 s，95℃5 s，60℃ 25 s，45 个循环。将基因表达水平标准化为肌动蛋白基因，并使用2－△△Ct分析方法进行计算。实验重复3次，取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6.5 Western blot 检测大鼠踝关节滑膜和脾脏组织Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表达水平变化

提取大鼠踝关节滑膜组织和脾脏组织总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。取20 μg 蛋白上样，SDS-PAGE 电泳，半干转膜法将蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入Notch2（1∶1000）、DLL1（1∶1000）、NF-κBp65（1∶1000）和GAPDH（1∶3000）一抗4℃孵育过夜。加入二抗（1∶3000）室温孵育1 h，ECL 显色液显色并曝光拍照。使用Gelpro32软件测定目标条带灰度值。实验重复3次，取平均值。

1.6.6 免疫组织化学检测大鼠踝关节滑膜和脾脏组织Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白阳性表达变化

将固定的踝关节修剪、脱钙、脱水处理，石蜡包埋，切成4 μm 薄片。切片烘干并脱蜡脱水处理后，在高温高压下使用枸橼酸缓冲液抗原修复3 min。室温下山羊血清封闭液封闭20 min 后，加入Notch2（1∶100）、DLL1（1∶100）、NF-κBp65（1:200）一抗，湿盒内4℃孵育过夜。滴加二抗，37℃恒温20 min。滴加DAB显色液进行显色。使用苏木精复染细胞核1 min，脱水透明，使用中性树胶封片。使用显微镜观察并拍照。Image J 软件统计免疫组化阳性区域比例。实验重复3次，取平均值。

1.6.7 大鼠肝肾功能水平变化检测

按照试剂盒说明书，检测各组大鼠血清肝功能ALT、AST水平变化情况及肾功能BUN、Cr水平变化情况。实验重复3次，取平均值。

1.7 统计方法

使用SPSS 26.0 软件进行统计分析。所有数据以均值±标准差（±s）表示，如果符合正态分布，采用双因素方差分析统计关节炎指数评分，其他实验数据采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD 法进行多重比较，方差不齐时则采用Tamhance’s T2 法进行多重比较。如果不符合正态分布，则采用非参数检验。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠关节炎指数评分变化

大鼠关节炎指数评分结果显示（表2），第14天，模型组和傅山风湿外治方大鼠关节炎指数评分显著高于正常组，评分均大于4 分，表明CIA 大鼠模型构建成功。第14-42 天，傅山风湿外治方组大鼠关节炎指数评分与模型组相比无显著差异（P>0.05）。第49-56天，傅山风湿外治方组大鼠关节炎指数评分显著低于模型组（P<0.05，P<0.01）。

表2 各组大鼠关节炎指数评分变化（±s，n=10）

表2 各组大鼠关节炎指数评分变化（±s，n=10）

注：与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

组别正常组模型组傅山风湿外治方组第14天0.00±0.00 5.50±2.66##8.17±1.47第21天0.00±0.00 6.50±2.88##6.83±2.14第28天0.00±0.00 7.33±3.20##6.67±2.94第35天0.00±0.00 8.33±3.72##7.33±2.73第42天0.00±0.00 8.17±2.86##6.33±2.42第49天0.00±0.00 10.17±1.94##6.50±3.83*第56天0.00±0.00 9.67±2.94##5.17±5.17**

2.2 各组大鼠踝关节病理学变化

通过HE 染色对各组大鼠踝关节病理学的评估表明，与正常组相比，模型组大鼠踝关节结构破坏增加，滑膜细胞增生，关节软骨被侵蚀且炎性细胞浸润。与模型组相比，傅山风湿外治方组大鼠异常明显减轻（图1）。病理学评分结果表明（表3），与正常组相比，模型组大鼠踝关节病理学评分显著升高（P<0.01）。与模型组相比，傅山风湿外治方大鼠大鼠踝关节病理学评分显著降低（P<0.01）。

表3 各组大鼠踝关节病理学评分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表达水平变化（±s，n=10，pg·mL-1）

表3 各组大鼠踝关节病理学评分及血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ表达水平变化（±s，n=10，pg·mL-1）

注：与正常组相比， ##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。

组别正常组模型组傅山风湿外治方组滑膜病理学评分0.00±0.00 2.80±0.52##1.35±0.28**TNF-α 1.61±0.11 6.18±0.25##2.68±0.14**IL-6 1.15±0.05 81.40±4.54##18.82±0.74**IL-17 2.50±0.13 8.82±0.60##5.14±0.15**IFN-γ 1.41±0.11 10.64±0.36##3.38±0.12**

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17和IFN-γ 表达水平变化

ELISA 检测结果显示（表3），与正常组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组相比，傅山风湿外治方组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 表达水平显著降低（P<0.01）。

2.4 各组大鼠踝关节滑膜和脾脏Notch2、DLL1 和NF-κBp65 mRNA表达水平变化

qRT-PCR 结果显示（表4），与正常相比，模型组大鼠踝关节滑膜和脾脏组织中Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA的表达显著升高（P<0.01）。与模型组相比，傅山风湿外治方组大鼠踝关节滑膜和脾脏组织中Notch2、DLL1和NF-κBp65mRNA的表达显著降低（P<0.01）。

表4 各组大鼠踝关节滑膜和脾脏Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表达水平（±s，n=10）

表4 各组大鼠踝关节滑膜和脾脏Notch2、DLL1和NF-κBp65 mRNA表达水平（±s，n=10）

注：与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。

组别正常组模型组傅山风湿外治方组关节脾脏NF-κBp65 1.00±0.00 4.26±0.03##0.84±0.06**Notch2 1.00±0.00 4.17±0.06##1.51±0.19**DLL1 1.00±0.00 2.35±0.11##1.40±0.07**NF-κBp65 1.00±0.00 3.52±0.37##1.85±0.14**Notch2 1.00±0.00 4.22±0.30##1.02±0.08**DLL1 1.00±0.00 2.43±0.04##0.87±0.04**

2.5 各大鼠踝关节滑膜和脾脏Notch2、DLL1 和NFκBp65蛋白表达水平变化

Western blot 检测结果显示（图2 和表5），与正常组相比，模型组大鼠踝关节滑膜和脾脏组织中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 蛋白的表达显著升高（P<0.01）。与模型组相比，傅山风湿外治方组大鼠踝滑膜关节和脾脏组织中Notch2、DLL1 和NF-κBp65 表达显著降低（P<0.01）。

图2 各大鼠踝关节滑膜和脾脏Notch2、DLL1和NF-κBp65蛋白表达水平

表5 各组大鼠踝关节滑膜和脾脏Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表达水平（±s，n=10）

表5 各组大鼠踝关节滑膜和脾脏Notch2、DLL1和NF-κBp65 蛋白表达水平（±s，n=10）

注：与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。

组别正常组模型组傅山风湿外治方组关节脾脏NF-κBp65 0.77±0.24 1.21±0.18##0.16±0.05**Notch2 0.58±0.30 2.31±0.59##0.80±0.06**DLL1 0.98±0.21 3.87±0.27##2.00±0.06**NF-κBp65 0.83±0.22 1.26±0.28##0.24±0.09**Notch2 0.82±0.19 2.74±0.06##1.20±0.06**DLL1 0.67±0.61 1.79±0.04##0.28±0.01**

2.6 各组大鼠踝关节Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫组织化学分析

免疫组织化学检测显示（图3 和表6），正常组、模型组、傅山风湿外治方组大鼠踝关节成纤维滑膜细胞和巨噬细胞等均有不同程度的Notch2、DLL1 和NFκBp65 阳性表达。与正常组相比，模型组大鼠踝关节Notch2、DLL1 和NF-κBp65 阳性表达增多（P<0.01）。与模型组相比，傅山风湿外治方组大鼠踝关节Notch2、DLL1和NF-κBp65阳性表达减少（P<0.01）。

图3 各组大鼠踝关节Notch2、DLL1和NF-κBp65 免疫组化代表性图像（×100）

表6 各组大鼠踝关节Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫组化分析（±s，n=10）

表6 各组大鼠踝关节Notch2、DLL1和NF-κBp65免疫组化分析（±s，n=10）

注：与正常组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。

NF-κBp65 3.59±0.49 40.82±2.12 ##28.13±3.20**组别正常组模型组傅山风湿外治方组Notch2 1.39±0.16 31.26±1.91##13.77±1.60**DLL1 3.14±0.66 41.60±2.10 ##19.38±1.10**

2.7 各组大鼠肝肾组织病理学和血清AST、ALT、BUN、Cr水平

肝肾组织病理学结果表明（图4），模型组和傅山风湿外治方组大鼠的肝肾组织均未见明显的病理损伤。血清AST、ALT、BUN和Cr水平检测结果表明（表7），傅山风湿外治方组大鼠血清AST、ALT、BUN和Cr无显著变化（P>0.05）。

表7 各组大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

表7 各组大鼠血清AST、ALT、BUN、Cr水平（±s，n=10）

组别正常组模型组傅山风湿外治方组AST（U·L-1）43.74±3.06 42.90±3.56 43.84±3.97 ALT（U·L-1）186.75±18.10 181.81±23.83 187.14±29.25 BUN（mmol·L-1）5.44±0.69 5.60±0.64 5.56±0.72 Cr（mmol·L-1）0.12±0.02 0.11±0.05 0.12±0.05

3 讨论

傅山风湿外治方包括牛皮胶、天南星、生姜、羌活、乳香和没药等药味，具有祛风胜湿、散寒止痛、活血消肿等功效。牛皮胶属于皮胶类药物，主要偏于外用，主要成分为明胶[11]。明胶作为一种变性胶原蛋白，已被证明是一种有吸引力的药物载体材料[12]。胶原蛋白经酶水解后被吸收并分布到关节组织，具有镇痛和抗炎特性[13]。天南星含有类黄酮成分，具有良好的抗炎、镇痛等药理作用[14]。生姜及其主要成分酚类化合物具有抗氧化和抗炎活性[15]。羌活被广泛用于RA 治疗，主要含有香豆素和酚酸类化合物，具有镇痛和抗炎活性[16]。乳香和没药作为经典药对，具有协同抗炎、镇痛及促进透皮等作用[17]。本研究表明，傅山风湿外治方降低了CIA 大鼠的关节炎指数评分和病理学评分，减少了关节损伤，缓解了CIA大鼠的关节炎严重程度，说明傅山风湿外治方各味药共同发挥了对关节炎的治疗作用。

慢性炎症是RA 的重要病理特征，炎性细胞因子在RA 中的表达水平与RA 患者慢性滑膜炎的严重程度呈正相关[18]。TNF-α、IL-6 和IFN-γ 炎性细胞因子渗入滑膜中将促进炎症反应的产生，导致关节破坏[19]。而IL-17 会刺激RA 滑膜成纤维细胞产生炎性细胞因子，引发RA 的骨侵蚀和组织破坏[20]。因此，抑制炎性细胞因子将有助于改善RA 的炎症反应和关节破坏。本研究对血清炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-17 和IFN-γ 的表达水平进行了检测，发现傅山风湿外治方降低了炎性细胞因子的表达，表明傅山风湿外治方对RA的治疗作用可能与其抗炎作用有关。

RA 的关节损伤往往和破骨细胞活性增强密切相关，Notch2 被认为是RA 破骨细胞活化的重要效应分子，Notch2/DLL1 轴对破骨细胞生成的调节可能是改善RA患者骨侵蚀的重要靶点[21]。同时，炎性细胞因子促进了Notch2 的表达和信号转导，这种炎性细胞因子介导的Notch2激活依赖于NF-κBp65与启动子之间的直接相互作用[22]。在炎症环境中，Notch2 与NF-κB 和炎性细胞因子形成正反馈，增强破骨细胞活性、促进骨侵蚀、导致骨破坏[23]。因此，本研究重点从Notch2信号通路对傅山风湿外治方的治疗机制进行了探讨。本研究中，CIA 大鼠Notch2/DLL1 轴异常激活，NFκBp65 表达升高，而傅山风湿外治方治疗降低了Notch2、DLL1和NF-κBp65在mRNA 和蛋白水平的表达，表明傅山风湿外治方可能通过抑制Notch2/DLL1轴在RA 中的激活，阻断Notch2 与NF-κB 和炎性细胞因子的正反馈，发挥了对关节炎的治疗作用。此外，傅山风湿外治方的安全性缺乏客观证据，因此本研究主要通过检测对肝肾功能的影响进一步探讨了其安全性，结果表明对肝肾无毒副作用。

综上，傅山风湿外治方可缓解CIA 大鼠的关节炎症状，减轻关节损伤，且对肝肾无毒副作用，其机制可能与降低炎性细胞因子，下调Notch2、DLL1 和NFκBp65的表达有关。但由于目前尚无公认的用于类风湿关节炎治疗的外用药物，本研究未设置阳性对照组。此外，本研究未能完全阐明傅山风湿外治方对炎性细胞因子的调节是否与Notch2/DLL2 轴以及NFκBp65 的协同作用有关，其相互作用和具体机制有待进一步探讨。本研究为傅山风湿外治方治疗RA 提供了研究基础和思路，也为RA 外用药物的发掘提供了参考，然而傅山风湿外治方作为一种治疗RA 的外用药物在临床的应用和推广仍然需要更深入的基础和临床研究。