SCX-SPE结合UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS分析草乌中的四类二萜生物碱＊

周红燕，徐 静，崔议方，宋书祎，兰先明，汪 冰，张加余＊＊

（1. 山东中医药大学药学院 济南 250300；2. 滨州医学院药学院 烟台 264003；3. 山东省食品药品检验研究院 济南 250101）

乌头类中药是重要的传统中药，药用历史悠久，资源丰富，且临床应用广泛。草乌始载于《神农本草经》[1]，其味辛、苦，性热，有大毒，具有祛风除湿、温经止痛的功效。2020 版《中国药典》一部规定草乌（Radix Aconiti Kusnezoffii）为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffiiReichb.的干燥块根。其多于秋季北乌头茎叶枯萎时采挖，除去须根和泥沙，干燥而成[2]。现代研究表明，草乌的主要药理活性为镇痛、抗炎、抗心律不齐、抗癌和强心作用[3-4]；在农药领域可用于毒杀害虫、忌避、拒食、抑制昆虫生长发育等[4]。草乌化学成分组成复杂，主要为二萜生物碱，其次还有挥发油[5]、氨基酸[6]、多糖[7-8]等化学成分。其中，二萜生物碱药理活性显著，具有较好的研究潜力与价值。因此，近年来专家学者们对二萜生物碱进行了集中研究，不仅从乌头属植物中发现了大量新化合物，而且还对二萜生物碱进行了归纳分类，将其按结构类型分为C-18 型、C-19 型、C-20 型及双二萜生物碱等[9]。研究发现，二萜生物碱是草乌中主要的药理活性成分，具有抗菌抗炎、镇痛麻醉、抗肿瘤等生物活性[10]。

目前，液质联用（LC-MS）技术在乌头类生物碱鉴定方面已有较多报道[11-17]。例如，叶先文等[11]、叶协滔等[12]利用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术分别对乌头属植物川乌、草乌炮制前后的化学成分进行了比较，发现了生品及制品的主要成分差异。Yue 等[13]采用HPLCESI-MSn在附子中发现了117种化合物，并结合质谱裂解途径鉴定或推断出了其中的111种化合物。虽然有关乌头属植物成分的研究较多，然而，由于部分二萜类生物碱含量低，且存在大量的同分异构体，纯化分离难度大，目前对草乌所含的二萜生物碱成分的结构表征并不全面，在草乌中发现的二萜生物碱数量较少[18-27]。

二萜生物碱是草乌的重要成分，在中性或酸性条件以阳离子形式存在，能与阳离子交换树脂的氢离子交换而吸附于树脂上，从而与其他非离子性成分分离，达到精制纯化草乌中二萜生物碱的目的。因此，本文采用具有分离机理明确、专属性强、成本低、操作简便等优势的强酸性阳离子交换树脂固相萃取柱（SCX-SPE）分离纯化草乌中的生物碱类成分，以期提高生物碱的提取效率，使一些低含量生物碱得以纯化富集，从而大大增加LC-MS 的检出容量；采用超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-QExactive Orbitrap MS）技术对草乌中的二萜生物碱成分进行分析鉴定，以期为其全面的成分分析表征及其相关作用机制研究提供参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

R200D型十万分之一电子分析天平：德国Sartorius公司产品；Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪与Q-Exactive 组合型四极杆Orbitrap 质谱仪：美国Thermo Scientific 公司产品，配有电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur 2.2数据处理系统；TGL20M型高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技有限公司产品；旋涡混合器QL-861：江苏其林贝尔仪器制造有限公司产品；KQ-250 DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

草乌为中国食品药品检定研究院民族药室2019年中药饮片抽检工作中所收集，并经中国食品药品检定研究院民族药室郑健研究员鉴定为毛茛科植物北乌头（Aconitum kusnezoffiiReichb.）的干燥块根。

苯甲酰新乌头原碱（批号111785-201805，纯度93.1%）；苯甲酰乌头原碱（批号111794-201705，纯度99.1%）；苯甲酰次乌头原碱（批号111796-201705，纯度98.6%）；乌头双酯型生物碱对照提取物（112029-201601，其中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的含量分别为31.8%、31.7%、30.0%）均购自中国食品药品检定研究院。

屈臣氏蒸馏水：广州屈臣氏食品饮料有限公司产品；氨水、乙腈：色谱纯，天津康科德科技有限公司产品。SPE固相萃取柱：型号StrataX-C，平均粒径33 μm，平均孔径85 Å，Polymetric strong cation 200 mg/3 mL。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温35℃；流动相为0.1%氨水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0-3 min，15% B；3-10 min，15-40% B；10-16 min，40-70% B；16-20 min，70-90%B；20-23 min，90-15% B；23-25 min，15% B；流速0.25 mL·min-1；进样量1 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；Full MS/dd-MS2扫描模式进行采集，一级扫描分辨率为70000，傅立叶高分辨扫描范围m/z50-1200，归一化碰撞能量（NCE）为20、40、60 eV；正离子检测模式；毛细管温度320℃；鞘气流速35 Arb；辅助气流速10 Arb；喷雾电压3.8 kV。

1.4 对照品溶液制备

称取乌头双酯型生物碱对照提取物以及3种单酯型生物碱（苯甲酰乌头碱、苯甲酰次乌头碱、苯甲酰新乌头碱）各5 mg，分别置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，即得各对照品母液。分别精密吸取各对照品母液0.1 mL，定容至10 mL，配制成质量浓度为0.01 mg·mL-1的草乌混合对照品溶液。

1.5 供试品溶液制备

1.5.1 生物碱类成分的提取

取草乌粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1%盐酸-甲醇（7∶3）混合溶液25 mL，超声处理（功率300 W，频率40 kHz；水温40℃以下）30 min，放冷，摇匀后，离心（4000 r/min）15 min，取上清液，即得。

1.5.2 SPE活化

用固相萃取洗脱装置，负压泵减压洗脱，依次以甲醇、水各3 mL 及0.1 mol·L-1盐酸溶液6 mL 对SCXSPE柱进行活化处理。

1.5.3 供试品溶液的制备

精密量取上述草乌生物碱提取液10 mL，分次加入已活化的强阳离子吸附树脂固相萃取柱中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液6 mL分次洗涤，再分别用水、甲醇各6 mL 洗涤，弃去洗涤液，最后用氨水-无水乙醇（1∶6）混合溶液10 mL 洗脱，收集全部洗脱液（约9 mL），减压回收溶剂（40℃以下）至干，残渣精密加入含有0.1%甲酸的甲醇溶液3 mL溶解，滤过，即得。

1.6 数据采集处理

利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技术采集数据，并将数据导入Thermo Xcalibur Qual Browser 软件，对数据进行色谱峰提取、质谱碎片离子峰匹配。相关参数设定为C [0-70]、H [0-120]、O [0-40]、N [0-5]、环不饱和双键数（RDB）[0-15]，质量精度误差在5×10-6以内。

2 结果

本文采用SCX-SPE 结合UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 联用技术对草乌中的二萜生物碱进行提取与分析，获得了正离子模式下草乌药材样品溶液的基峰图（Base Peak Chromatogram，BPC）（图1）。结合精确分子量、多级质谱裂解规律、对照品及ClogP值并参考相关文献，对各质谱峰进行归属。结果共从草乌提取物中鉴定出99 个二萜生物碱（见表1），其中包括C19 型二萜生物碱（78 个）和C20 型二萜生物碱（21个）。从二萜生物碱分类来看，则包括四类二萜生物碱，即双酯型二萜生物碱（DDA）27 个，单酯型二萜生物碱（MDA）29 个，酰胺型二萜生物碱（ADA）40 个，多酯型二萜生物碱（PDA）2 个以及长链酯型二萜生物碱（LDA）1个。

表1 草乌中鉴定的的二萜生物碱类成分

续表

图1 草乌样品中二萜生物碱类成分的BPC图

2.1 双酯型二萜生物碱的鉴定

双酯型二萜生物碱是草乌抗炎、镇痛的主要药效成分，对心血管系统和神经系统具有较强的药理作用，同时这类成分也具有极大的毒性。研究发现，C-14 位的苯甲酰基（-OCOC6H5）和C-8 位的乙酰基（-OCOCH3）在致毒方面起关键作用。

常见的双酯型二萜生物碱有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等。以对照品乌头碱为例，对其质谱裂解途经和规律进行分析。在正离子检测模式下，其二级质谱图观察到m/z646 [M+H]+、m/z614 [M+H-CH3OH]+、m/z554[M+H-AcOH-CH3OH]+、m/z414 [M+H-C6H5COOHAcOH-CH3OH-H2O]+、m/z105 [C7H5O]+及m/z58 [C3H8N]+等碎片离子（见图2）。研究结果表明，双酯型二萜生物碱骨架上的取代基多为羟基、甲氧基、C8-乙酰基、C14-苯甲酰基，在二级质谱裂解过程中易脱掉这些取代基，从而造成18 Da（H2O）、32 Da（CH3OH）、60 Da（AcOH）和122 Da（BzOH）等质量丢失，产生相应的特征碎片离子。此外，碎片离子m/z105 [C7H5O]+为苯甲酰基的特征离子。

图2 乌头碱二级质谱图及裂解规律图

本文利用SCX-SPE 结合LC-MS 技术从草乌中共鉴定出27种双酯型二萜类生物碱。其中，通过对照品比对，可将化合物M60、M71、M92 分别准确鉴别为新乌头碱、乌头碱和次乌头碱。此外，M55 和M60 具有相同的分子式C33H45NO11，推测M55 为新乌头碱的同分异构体。在M55 的二级质谱图中观察到碎片离子m/z600 [M+H-CH3OH]+、m/z572 [M+H-CH3OH-CO]+、m/z512[M+H-CH3OH-CO-AcOH]+、m/z390 [M+H-CH3OHAcOH-CH3OCH3-C7H4O]+，未发现C3位羟基的丢失，参考文献[20,27]及ClogP值（新乌头碱ClogP值1.9076；10-羟基次乌头碱ClogP值1.6321），最终推测M55 为10-羟基次乌头碱。同样地，根据质谱数据并结合文献报道[11,14,16,19-20,27-28]，其他23个双酯型生物碱也被逐一鉴定。

2.2 单酯型二萜生物碱的鉴定

单酯型二萜生物碱主要表现在C-14 位上的羟基被酯化，多数为苯甲酰基，少数为乙酰基或桂皮酰基。主要代表成分为苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱和苯甲酰次乌头碱等。

本文从草乌中共鉴定出29 个单酯型二萜类生物碱。通过对照品比对，化合物M28、M49和M84可被准确鉴定为苯甲酰中乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酰次乌头碱。此处对苯甲酰乌头碱的质谱裂解规律进行了细致分析，以便于其他单酯型二萜生物碱的结构鉴定。在正离子检测模式下，M49 的二级质谱图中可观察到碎片离子m/z604 [M+H]+、m/z554 [M+H-H2OCH3OH]+、m/z416 [M+H-C7H6O-2CH3OH-H2O]+、m/z384 [M+H-C7H6O-3CH3OH-H2O]+、m/z105 [C7H5O]+和m/z58 [C3H8N]+等，见图3。结合其他参考文献发现，单酯型二萜生物碱容易脱去失去C6H5COOH 或AcOH、H2O、CH3OH 等中性分子，形成[M+H-122]+（[M+H-106]+）或[M+H-60]+、[M+H-18]+、[M+H-32]+、[M+H-50]+、[M+H-64]+、[M+H-82]+等碎片离子[17]。

图3 苯甲酰乌头碱的二级质谱图及裂解规律图

在正离子模式下，检测到M3、M6、M11、M14 具有相同的分子式，且在此4 个化合物的二级质谱图中均检测到m/z328 [M+H-AcOH]+、m/z310 [M+H-AcOHH2O]+、m/z282 [M+H-AcOH-H2O-CO]+等碎片离子，表明化合物的结构中含有乙酰基，符合C-14 位为乙酰基的单酯型生物碱的裂解规律，最终将他们鉴定为关附Y 素及其同分异构体。同样地，根据质谱数据和单酯型二萜生物碱的裂解规律，结合文献报道[17,19,22-23,29-30]，其他22 个单酯型二萜类生物碱也被逐一鉴定。

2.3 醇胺型二萜生物碱的鉴定

醇胺型二萜生物碱是草乌中主要的无毒活性成分。采用SCX-SPE 结合LC-MS 技术，在草乌中共鉴别出40个醇胺型二萜生物碱，主要代表成分为乌头原碱、尼奥宁、牛扁碱等。

醇胺型二萜生物碱容易失去CH3OH、H2O和CO等中性分子。M2 的二级质谱图可观察到m/z486 [M+H]+、m/z436 [M+H-CH3OH-H2O]+、m/z354 [M+H-2H2O-3CH3OH]+等碎片离子，见图4，结合参考文献，初步鉴定M2为新乌头原碱。化合物M12、M17和M25的色谱峰相对较高，含量较高，分子式相同，推测它们互为同分异构体，且主要表现在甲氧基和羟基的位置异构[19]。根据质谱数据并结合参考文献[11]及ClogP值，推测它们分别为10-羟基尼奥宁（ClogP值-1.0020）、弗斯生（ClogP值-0.5706）、附子灵（ClogP值-0.5346）。附子灵又名森布星C，在其二级质谱图中观察到m/z422 [M+H-CH3OH]+、m/z404 [M+H-CH3OH-H2O]+、m/z344 [M+H-2CH3OH-CH3OCH3]+等离子，表明其结构上具有甲氧基、羟基及甲基氧基等基团。

图4 新乌头原碱的二级质谱图及裂解规律图

同样地，其他醇胺型二萜生物碱化合物具有类似的裂解规律，根据其质谱数据结合文献报道，其他38个醇胺型二萜生物碱逐一被鉴定。

2.4 长链酯型生物碱的鉴定

长链酯型生物碱在结构上和双酯型生物碱类似，仅有的区别为C8位乙酰基被脂肪酰基取代，在裂解过程中，长链酯型生物碱首先脱去脂肪酸，进一步的裂解途径与相应的双酯型生物碱相同。

在正离子模式下，M99 的准分子离子峰为m/z852[M+H]+，二级裂解碎片为m/z572 [M+H-C18H32O2]+、m/z540 [M+H-C18H32O2-CH3OH]+、m/z512 [M+H-C18H32O2-CO]+、m/z374 [M+H-C18H32O2-C6H5COOH-CH3OH-CO2]+、m/z105 [C7H5O]+等，见图5。根据其质谱数据结合文献报道[20]，推测M99为8-亚油酸残基-苯甲酰新乌头碱。

图5 8-亚油酸残基-苯甲酰新乌头碱的二级质谱图及裂解规律图

3 讨论

中药成分复杂，传统的色谱法虽然能够将其分离开来，但无法准确地进行定性和结构分析，对于未知成分的结构鉴定十分困难。固相萃取技术是一种样品前处理新技术，相比传统的液液萃取，固相萃取具有操作更加方便、除杂效果更好、目标成分回收率更高等优点。本文利用SCX-SPE 分析方法，选用氨水-无水乙醇（1∶6）混合溶液为洗脱液，有效消除了草乌中生物碱测定时的阴性干扰，显著改善了方法的专属性、灵敏度、重复性和准确度，快速实现了对乌头属植物草乌中二萜生物碱的富集纯化。此外，液质联用技术在中药成分分析研究发挥了巨大作用，其将液相色谱的高分离度与质谱高选择性、高灵敏度和能够提供物质结构信息的特性进行优势互补，具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、自动化程度高等优点。同时能够得到化合物保留时间、分子量及特征二级结构碎片等丰富的信息。本文利用UHPLC-QExactive-Orbitrap MS 技术，对草乌二萜生物碱成分进行了全面表征，并对其进行了快速、准确地定性研究。结果从草乌提取物中鉴定出99个二萜生物碱类成分，包括27 个DDA，29 个MDA，40 个ADA，2 个PDA 以及1个LDA。

研究发现草乌BPC 图中某些化合物的色谱峰较高，响应值较高，相对含量可能较多，且大多为毒性较强的双酯型生物碱（如乌头碱、次乌头碱、N-去甲基次乌头碱等）及少数醇胺型生物碱（附子灵、尼奥宁、宋果灵等）。本研究将SCX-SPE 与UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS/MS 结合起来，不仅检测到在乌头属植物中具有代表性的二萜生物碱（如乌头碱、次乌头碱和新乌头碱等），而且发现了一些生物活性较好低含量成分（如3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱等）。其中，3-乙酰乌头碱属于三酯型生物碱，为乌头碱的简单衍生物，具有优良的镇痛活性，已成为非成瘾性镇痛药应用于临床。研究表明，3-乙酰乌头碱还具有抗肿瘤活性，可抑制人肝癌细胞的生长[31]。去氧乌头碱具有抗炎阵痛和解热作用，且抗炎和镇痛效果显著高于3-乙酰乌头碱[32]。关附甲素具有抗氧化和抗房颤作用，可作为抗心律失常药物应用于临床[33]。此外，本研究还检测到了草乌所含的一些微量生物碱（如草乌甲素）及部分生物碱的微量同分异构体（如关附Y 素，检测到包括其在内的4 个同分异构体）。由于同分异构体仅通过二级碎片离子较难鉴定出其准确结构，后续会结合核磁共振技术继续对这些同分异构体进行鉴定。本研究还发现了一种长链酯型生物碱8-亚油酸残基-苯甲酰新乌头原碱。但是，本研究发现的该类成分数量很少，可能原因是一方面它们在提取过程中可能会发生水解脱去一分子的脂肪酸碎片，另一方面可能是由于该类成分极性小在色谱柱上难以被洗脱下来而无法被检测到。

生草乌毒性较大，目前相关的开发利用相对较少，临床上通常采用炮制及配伍的方法达到减毒增效的目的。充分研究草乌中的化学成分，有利于丰富乌头属植物的化学成分谱系，还有利于为药物研发提供活性先导化合物进而指导新药的研究与开发。在今后的工作中可以着重对生草乌及制草乌中新的活性成分和多成分、多靶点、多疗效进行深入研究，为草乌药材的临床应用提供更充分的科学依据。