高效液相色谱法同时测定艾绒中4 种成分

任荣军，湛建峰△，陈虹球，卢大良，江宏池

（1. 湖南省岳阳市检验检测中心，湖南 岳阳 414022； 2. 湖南理工学院，湖南 岳阳 414006； 3. 湖南省高圣生物科技股份有限公司，湖南 岳阳 414301）

艾绒是制作灸疗用品的主要原料，其质量直接影响临床效果［1-5］。其为菊科植物艾Artemisia argyiLévl. et Van. 的叶片及叶杆经反复晒杵、捶打、碾碎，筛去梗，去除杂质及微小粉尘而得到的细软绒状物。2020 年版《中国药典（一部）》艾叶项下炮制品仅收载了醋艾炭，而未收载艾绒［6］，同时，全国共有15 个省（自治区）市的中药炮制规范中收载了艾绒及其炮制方法，但无相关的质量标准内容。有研究报道，艾叶中酚酸类含量达3.28%～4.81%，是主要潜在的药效活性物质之一［6-10］。鉴于此，本研究中建立了同时测定艾绒中绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 含量的高效液相色谱（HPLC）法，以为其质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2695e/2489 型高效液相色谱仪，含二极管阵列检测器（美国Waters公司）；XS-105型电子分析天平（梅特勒- 托利多仪器< 上海> 有限公司，精度为0.01 mg）；SB 5200D 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110753 - 201716，含量99.3%）；异绿原酸A 对照品（批号为B21539，含量98%），异绿原酸B 对照品（批号为B21540，含量98%），异绿原酸C 对照品（批号为B21541，含量98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；艾绒样品（湖南省高圣生物科技股份有限公司，批号分别为20210101，20210201，20210301，等级分别为1，2，3 级，编号分别为S1，S2，S3）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C1（82）100A柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min 时10%A →12%A，10～15 min时12%A →20%A，15～35 min 时20%A →28%A，35～36 min 时28%A →90%A，36～40 min 时90%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：325 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL［11-14］。

2.2 溶液制备

分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品9.86 mg、10.48 mg、11.86 mg、12.02 mg，精密称定，置同一20 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得混合对照品贮备液；精密量取1 mL，置25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，即得混合对照品溶液。取样品0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图相应位置有色谱峰，且分离度均大于1.5，理论板数按待测成分峰计均大于3 000。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Chlorogenic acid 2.Isochlorogenic acid B 3.Isochlorogenic acid A 4.Isochlorogenic acid CA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液（含绿原酸19.58µg/mL、异绿原酸A 20.54µg/mL、异绿原酸B 23.25 µg/ mL、异绿原酸C 23.56 µg/ mL）2，5，10，15，20µL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（X，ng）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 5）

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.92%，0.30%，0.34%，0.33%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密量取2.2 项下供试品溶液适量，室温下分别于0，2，4，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 峰面积的RSD分别为1.02%，0.34%，0.32%，0.31%（n=6），表明供试品溶液室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一样品适量，精密称定，共6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算平均含量。结果绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的平均含量分别为0.409，1.841，0.379，0.893 mg/ g，RSD分别为1.72%，1.72%，1.44%，1.32%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的同一样品（绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的平均含量分别为0.409，1.841，0.379，0.893 mg/g）约0.5 g，精密称定，分别精密加入混合对照品贮备液（含绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 0.489 5，0.524 0，0.593 0，0.601 0 mg/ mL）1 mL，水浴蒸干，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

耐用性考察：精密称取样品（编号S1）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件［色谱柱分别为Phenomenex Luna C18（2）100A 柱和Topsil C18柱，规格均为（250 mm × 4.6 mm，5 µm）］进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果表明，色谱柱发生变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

2.4 样品含量测定

取样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of the content determination of four components in samples（mg / g，n = 3）

3 讨论

现有报道对艾绒的质量标准研究较少，而采用HPLC法检测其活性成分含量的研究尚未见报道。武娟等［12］以蕲艾艾绒为研究对象，从挥发油、总黄酮含量、燃烧热值等方面进行了较系统的研究，笔者既往以湘艾艾绒为研究对象，在薄层鉴别、色值、总灰分、含绒量等方面对艾绒的等级分级标准进行了探索性研究，在薄层鉴别上采用艾叶作为对照药材，检视条件相比2020 年版《中国药典（一部）》［6］增加了荧光检视，可有效鉴别艾绒及其常见伪品青蒿；在等级标准研究中采用色值、总灰分和含绒量3个指标参数，可较好地对不同的艾绒样品进行等级划分。基于以上数据，本研究中拟建立能同时测定艾绒中4种成分含量的HPLC法。

预试验中，考察比较了甲醇- 0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液2 种流动相（等度洗脱），结果发现待测成分分离效果均不理想，又选择后者进行梯度洗脱，发现主峰峰形和分离度均较好；提取溶剂分别选择20%，50%，70%，90%甲醇，结果以50%甲醇提取时4种成分提取率均较高；考察比较了加热回流与超声处理2 种方法，提取结果差异无统计学意义，故选择简便快速的超声处理；同时考察了超声处理30，60，90 min时的效果，结果无显著差异，故选择超声处理30 min。样品含量测定结果表明，样品含绒量越高等级越高、4 种酚酸类成分含量越低。艾绒在制作过程中，筛选次数越多，含绒量和纯度越高，含艾叶碎片就越少，由此推断，艾绒中酚酸类成分主要存在于叶肉碎片中，但需通过分拣艾叶不同部位进行进一步检测加以证明。

综上所述，本研究中建立的HPLC 法操作简便，结果准确，重复性好，可用于艾绒的质量控制。