云南省3个海拔区域滇牡丹主要叶部病害发生动态分析

潘悦 杨贵钗 陈婉东 刘建福 王俊威 王娟

关键词：云南省；滇牡丹；海拔区域；叶部病害；动态分析

滇牡丹Paeo-nia dela'oayi属芍药科Paeoniaceae芍药属Paeonia，分布于滇中、滇西北至藏东南和川西南海拔1900～4000m的灌丛、林缘和林下等生境，是我国西南山地特有珍稀物种。滇牡丹表型性状多样、花色丰富，是具有较高观赏价值的特有园艺资源，同时其籽油中富含a-亚麻酸等多种不饱和脂肪酸，根皮有抗炎、镇痛等功效，因而发展滇牡丹种植产业对其优质种质资源的保护和利用具有重要意义。

近年来，云南省多地积极开展滇牡丹人工种植，然而病害的发生，尤其叶部病害的广泛传播严重影响了滇牡丹植株的生长、品质与产量。目前对滇牡丹病害的报道非常有限，缪福俊等发现红斑病、灰霉病和黑斑病是滇牡丹的主要病害，病原菌为牡丹枝孢Cladosporiurn paeonzae、牡丹葡萄孢Botrytispaeoniae和链格孢Alternarza alternata。而关于北方油用牡丹病害调查的报道则较多，研究表明山东菏泽牡丹栽培区红斑病发生普遍，80%的园区发病率在50%左右，重病园区发病率为90%，病情指数达20以上。该病于3月底至4月初发病，6月中旬至7月下旬为发病高峰，发生严重度与初侵染源、牡丹品种及土壤酸碱度等因素相关。宣俊好等对洛阳市4个牡丹种植区叶部病害样本进行分离鉴定，确定主要病害红斑病、炭疽病和黑斑病的病原菌分别为枝孢Cladosporiurn sp、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和链格孢Alternar-ia alternata。长沙地区的菏泽牡丹主要病害为灰霉病、褐斑病、红斑病、枝枯病和根腐病，发病高峰期为6月-8月，且病情随降雨量的增加而加重。赵旭等对甘肃临洮紫斑牡丹重点栽培区进行病害调查，发现其叶部病害为灰霉病、褐斑病、白粉病和病毒病。由此表明，叶部病害在牡丹组植物中尤为普遍，不同区域不同牡丹种类病害发生情况各有不同。

云南省是滇牡丹主要分布区，目前该区域叶部病害的发生动态未见报道。本研究通过选取云南省3个滇牡丹原生地所处海拔区域的种植基地开展叶部病害调查，结合不同区域的温度和降雨变化，探讨海拔、温度和降雨等环境因素对滇牡丹病害发生的影响，为滇牡丹病害防治提供参考依据。

1材料与方法

1.1样地选择

2021年3月至10月间，对云南省3个滇牡丹种植基地开展病害调查（样地具体信息详见表1），种植的滇牡丹均为4年生苗木。根据种植地实际面积，选取玉溪市梁王山和香格里拉高山植物园各1个样地，玉溪市稗子乡3个样地，每个样地1334m2，对滇牡丹叶部病害的主要种类和危害程度进行调查。每个滇牡丹样地内取3份土样等量混合后用四分法取10g风干土样，过筛混匀后按水土比2.5：1使用pH计进行土壤pH的测定。

1.2調查方法

每个样地采用五点取样法，每月中旬定点定株调查滇牡丹叶部病害种类及危害程度，每点50株，共计250株。滇牡丹红斑病的分级标准参照吴玉柱等，其他叶部病害参照易图永等的分级标准，统计每块样地不同病害的发病率及病情指数，发病率=发病株数／调查株数×100%；病情指数=∑（各级病株数×该病级值）／（调查总株数×最高级值）×100。

同时通过中国气象网（ http：∥WWW．weather．com. cn/）杏询记录调杏样地所在区域每月的月平均温度和降雨量。

1.3滇牡丹叶部病害的样品采集及病原真菌的分离纯化

每月在不同海拔区域滇牡丹种植基地分东西南北4个方位，每个方位随机采集4片症状明显的发病叶片编号装入自封袋后带回实验室进行病原菌的分离鉴定。从滇牡丹叶片病健交界处取0.5cm×0.5cm的组织，洗净晾干后，经75%乙醇浸泡2min，0.5%次氯酸钠溶液浸泡1min，无菌水漂洗3次，自然风干后，用灭菌镊子将其置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，每皿4块，25℃黑暗培养3～5d。分别挑取接种组织周围不同形态菌落的边缘菌丝转接于PDA培养基，25℃黑暗培养后将其纯化至单菌落，并接种于PDA斜面4℃保藏。

1.4滇牡丹叶部病害病原真菌的初步鉴定

将纯化后不同菌落形态的代表菌株接种于PDA培养基，25℃黑暗培养7d后，观察菌落的形态、颜色和质地等，并将链格孢属、枝孢属和刺盘孢属代表菌株分别接种于马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA）、PDA和玉米粉琼脂培养基（CMA），25℃自然光照培养5～10d，通过光学显微镜观察菌株的分生孢子梗、分生孢子等结构。

1.5数据分析

使用Excel 2016对滇牡丹3个海拔区域调查样地每月的病害发病率及病情指数进行统计，采用SPSS 17.0分析主要病害在不同海拔区域发病率、病情指数与温度、降雨量的相关性。使用Origin2018作图。

2结果与分析

2.1滇牡丹主要叶部病害症状特征

通过对云南省3个海拔区域滇牡丹种植基地的病害调查，发现稗子乡和梁王山种植的滇牡丹4月初开始出现叶部病害症状，8月底逐渐进入枯萎期，香格里拉种植的滇牡丹受高寒气候影响，6月初开始出现病状，10月底进入枯萎期。3个海拔区域种植的滇牡丹叶部病害主要有黑斑病、红斑病和炭疽病。其中黑斑病在发病前期叶片上出现圆形或椭圆形褐色小斑，随后病斑逐渐扩大，中部颜色更深或呈灰褐色。潮湿天气感病部位会覆黑色霉层，严重时病斑连片、穿孔，导致枯死和提前落叶（图1a～c）。红斑病前期叶尖和叶缘出现绿色或黄色针尖状小斑，随后逐渐扩大至圆形或不规则紫褐色病斑，后期病斑连片、枯焦（图1d～f）。炭疽病前期叶片出现圆形或不规则褐色小斑，病斑逐渐扩大，中央灰白色，边缘黄褐或紫褐色，受主脉和大侧脉限制，严重时病斑中部呈穿孔状（图1g～i）。

2.2滇牡丹同种叶部病害在云南省3个海拔区域的发生动态

如图2a～b所示，稗子乡和梁王山滇牡丹种植基地4月初出现黑斑病症状，5月-8月发病率和病情指数持续升高，8月发病率高达92.13%和86.80%，病情指数为39.42和42.44。香格里拉高山植物园滇牡丹6月开始出现症状，随后发病率和病情指数快速上升，8月后发病率增幅变缓，病害持续至10月，发病率和病情指数分别为75.20%和40.50。三地的滇牡丹黑斑病发病率呈现随海拔升高逐渐减弱的趋势。

稗子乡和梁王山种植基地的滇牡丹均在4月初开始出现红斑病症状，随后发病率和病情指数上升，其中梁王山红斑病发病率和病情指数较高，8月分别达76.40%和45.07。香格里拉高山植物园滇牡丹自6月开始出现红斑病症状，发病率和病情指数持续上升，10月达到发病高峰，分别为81.60%和31.40。结果表明，梁王山和香格里拉的滇牡丹红斑病发生较为严重（图2c～d）。

炭疽病较黑斑病和红斑病危害轻，稗子乡和梁王山的炭疽病发病率和病情指数缓慢上升，其中稗子乡的發病率和病情指数相对较高，8月分别为52.00%和26.68，而香格里拉的滇牡丹炭疽病仅少量发生，10月发病率为8.40%，与黑斑病发生情况类似，该病的危害程度有随海拔升高逐渐减弱的趋势（图2e～f）。

2.3滇牡丹3种叶部病害在云南省同一海拔区域的发生动态

如图3a～b所示，对于同一种植基地，稗子乡3种滇牡丹病害的发病率和病情指数均随时间推移逐渐升高，其中黑斑病发病率和病情指数急剧上升，为该地最严重的病害，其次是炭疽病，红斑病发病率和病情指数增幅较为缓慢，8月仅为43.07%和21.18，发病较轻。

梁王山3种滇牡丹病害中红斑病和黑斑病的发病率和病情指数随时间推移快速上升，其中红斑病在4月-7月发病率高于黑斑病，8月黑斑病发病率（86.80%）高于红斑病（76.40%），但二者8月的病情指数较为接近，分别为42.44和45.07。炭疽病发病率和病情指数呈缓慢上升的趋势，发病相对较轻，8月仅为22.80%和19.60（图3c～d）。

香格里拉的滇牡丹黑斑病和红斑病发生严重，二者的发病率和病情指数随时间推移上升幅度较快，10月发病率分别达75.20%和81.60%，而黑斑病的病情指数在8月后快速上升，10月达到40.50，后期高于红斑病（31.40）。炭疽病的发病率和病情指数在滇牡丹整个生长期增幅较缓，仅少量发生（图3e～f）。

2.4滇牡丹3个海拔区域月均温度、降雨量与叶部病害发病程度的相关性

根据气象资料显示，稗子乡和梁王山滇牡丹种植基地月平均温度和降雨量4月开始急剧上升，6月-8月为持续高峰期，与两地滇牡丹病害的发生动态相吻合。同时，稗子乡每月的平均温度和降雨量较高，6月-8月高峰期月均温度在21～22℃，月均降雨量在180～220mm的范围，其次是梁王山和香格里拉，三地的月平均温度和降雨量随海拔升高而降低，与滇牡丹黑斑病和炭疽病随海拔升高病害严重度逐渐减弱的趋势基本一致。

滇牡丹不同海拔区域3种叶部病害与温度、降雨量的相关性如表2所示。其中稗子乡的滇牡丹红斑病、炭疽病发病率与月平均温度显著相关（P<0.05），该地的黑斑病病情指数与月平均温度显著相关（P<0.05），红斑病和炭疽病病情指数与月平均温度相关性极显著（P<0.01）。而梁王山和香格里拉的滇牡丹病害发病率、病情指数与月平均温度无显著相关性（P>0.05）。

稗子乡滇牡丹3种病害的发病率、病情指数与月平均降雨量呈显著或极显著正相关。梁王山黑斑病的发病率、病情指数与月平均降雨量显著相关（P<0.05），而香格里拉种植的滇牡丹病害发病率、病情指数与月降雨量无显著相关性（P>0.05）。

2.5滇牡丹主要叶部病害病原菌的初步鉴定及数量统计

滇牡丹主要叶部病害病原菌的形态如图5所示。黑斑病病原菌菌落初期为白色，随后颜色加深为浅灰色，背面中央深褐至黑色，边缘颜色较浅（图5a），分生孢子为深褐色，单生或链状，卵形或长椭圆形，有横隔和纵隔（图5d）。红斑病病原菌菌落正面深绿色，背面墨绿色（图5b），分生孢子椭圆形或不规则形（图5e）。炭疽病病原菌菌落正面由初期白色变为浅灰色，菌丝短绒毛状，背面中央为深灰色，边缘较浅（图5b），分生孢子单胞，透明，椭圆形，内含物颗粒状，均匀分布（图5f）。根据菌落及分生孢子形态，初步确定黑斑病、红斑病和炭疽病的病原菌分别为链格孢属Alternaria、枝孢属Cladosporiurn和刺盘孢属Colletotrichum真菌。

3结论与讨论

滇牡丹在云南省3个海拔区域种植基地的叶部病害主要有黑斑病、红斑病和炭疽病，这与宣俊好等报道的洛阳地区牡丹3种主要叶部病害种类相一致。本研究中，黑斑病发生普遍且最为严重，8月3个试验基地的发病率均在60%以上，其中稗子乡种植基地的发病率高达92.13%，这与湖南省中原牡丹病害高峰期黑斑病的发病率在50%以上，严重的种植基地发病率为100%相似。红斑病在梁王山和香格里拉病害高峰期的发病率分别为76.40%和81.60%，病情指数为31.40和45.07，与湖南和山东菏泽牡丹种植基地的调查结果基本一致。

病害调查过程中，通过对典型病害的发病叶片进行采样及病原菌的分离，经形态学初步鉴定，确定了滇牡丹黑斑病、红斑病和炭疽病的病原真菌分别为链格孢属Alternaria、枝孢属Cladosporiurn和刺盘孢属Colletotrichurn.真菌，与段亚冰、缪福俊等、宣俊好等研究报道基本相符。结合多基因片段构建系统发育树和形态学鉴定，显示滇牡丹黑斑病、红斑病和炭疽病病原涉及链格孢属、枝孢属及刺盘孢属的数十个种，种类多样性较为丰富，进而表明滇牡丹同种叶部病害可能由同属的多个真菌种类共同侵染所致（另文发表）。

土壤pH对牡丹病害也能产生一定影响。吴玉柱等的研究表明，在碱性土壤环境中，土壤pH越高，牡丹红斑病发病越重，本研究中稗子乡种植区的滇牡丹红斑病发病相对较轻，可能与其土壤的弱碱性（pH 7.97）有关。而梁王山和香格里拉滇牡丹试验基地的红斑病发病较重，其土壤均为弱酸性。杜鹏研究表明，土壤pH为7.5、6.5的山核桃苗干腐病病斑直径及病情指数较土壤pH为4.5、5.5的山核桃苗低，然而滇牡丹红斑病的发生与土壤的pH是否有直接关系还有待进一步研究证实。

海拔高度和温湿度是影响滇牡丹病害发生的重要环境因素。本研究中，黑斑病和炭疽病的发病率以及病情指数呈现随海拔升高病害逐渐减弱的趋势。原因可能是低海拔区域的温度适宜病原菌的生长和定殖，同时，雨量丰富、田间湿度大利于病原菌孢子的萌发，并能借助雨水和气流加剧分生孢子的侵染和传播。本研究中，稗子乡和梁王山种植基地的病害发生动态与月平均温度、降雨量的变化规律基本一致，表明高温高湿利于病害发生，因而推断低海拔且温湿度较大的区域滇牡丹叶部病害发生较重。结合相关性分析，稗子乡3种滇牡丹病害的发病程度与月平均温度、降雨量显著或极显著正相关，梁王山黑斑病与月平均降雨量显著相关，表明两地的病害发生动态与温度、降雨量存在密切的关联。而香格里拉的发病程度与温度和降雨量无显著相关性，推测香格里拉的地理位置特殊、气候条件复杂多变，病害的形成可能还受其他环境因素的影响。

调查中发现，3个海拔区域的滇牡丹叶部病害除黑斑病、红斑病和炭疽病外，梁王山种植基地7月-8月还有部分白粉病和灰霉病发生，由于这2种病害在另外2个基地并未发现，因此本文没有对其发生规律进行动态分析。3个海拔区域的滇牡丹在病害高峰期往往同一叶片存在多种病害复合侵染的现象，推测其原因是单一病害的侵染造成植株损伤，导致其系统抗性下降，从而更易遭受其他病害的侵袭。目前针对滇牡丹多种病害同时发生的情况通常采用交替使用广谱类杀菌剂或是杀菌剂复配的方法进行防治。鉴于不同海拔区域的滇牡丹病害发病时间不同，稗子乡和梁王山可选择在4月底5月初开始防治，而香格里拉的防治时间可延后至6月底7月初。此外，种子的遗传背景作为决定其抗病性的重要因素，加强主要病害抗病种质资源的选育，也可作为将来滇牡丹推广种植过程中病害防治的有效途径。