环境DNA 技术在水域环境中的应用进展

刘科均，赖锡勋，向劲，桂雨婷，葛玲瑞*

（1.湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙 410126；2.湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153；3.湖南应用技术学院，湖南 常德 415000）

生物多样性是人类赖以生存的物质基础。近年来，由于石油钻井开采、水环境被破坏、生物资源过度开发及外来物种入侵等原因，许多水生生态系统的生物多样性正受到严重威胁，如内陆淡水生态系统湖泊、湿地等出现退化，海洋及沿岸地带的渔业资源急剧减少，非国家重点保护野生动物种群下降趋势明显，遗传资源也在不断丧失和流失，部分珍贵和特有的渔业种质资源流失问题严重[1]。传统的水生生物资源调查方法，耗时长、成本高、操作方法烦琐，难以在流域开展大规模渔业资源调查。因此，迫切需要更加便捷、精准且有效的生物资源调查方法。

环境DNA（environmental DNA, eDNA）是指从环境（水体、土壤、沉积物、冰、空气等）中提取DNA 片段，包括皮肤表皮细胞、粪便、体液等胞内DNA，以及动物机体出现损伤所释放到环境的胞外DNA[2-4]。环境DNA 技术则是将提取到的DNA 片段通过DNA 测序技术，对目标生物进行定性和定量分析，从而获得目标生物在生态系统中的分布情况等[5]。该技术能够快速检测出水域环境中的稀有种、濒危种及入侵种等，是一种新型的生物资源调查方法。现简述环境DNA 技术的发展进程，及其在物种多样性监测、生物量评估、入侵物种和珍稀物种监测等方面的应用，以期为水生生态系统生物多样性研究工作提供一定参考。

1 环境DNA 发展进程

1987 年Ogram 等[6]成功从海洋沉积物中分离出微生物DNA，首次提出环境DNA 的概念。20 世纪90 年代末，科学家利用鲸鱼粪便来区分不同鲸鱼种类，为eDNA 技术在水生生态系统中的应用提供了灵感。直到2008 年，Ficetola 等[7]利用eDNA 技术，对美国牛蛙入侵进行监测，首次证明了eDNA 技术适用于水生生态系统的可行性，推动了eDNA 技术在水生生物监测中的推广与应用[8]。2012 年，科学家们逐渐将研究重心转移到利用eDNA 技术对水域中某一特定物种进行实时监测，意味着eDNA 技术在水域环境中的应用由定性转变为相对定量，由单一物种监测发展到同时监测多种物种以及对特定物种的监测[9]。应用范围从最初的池塘、湖泊、河流、水库等淡水水域拓展至海水水域。调查物种从低等过渡到高等，包括细菌和古菌、真菌、浮游生物、植物、软体动物、节肢动物、鱼类、两栖爬行类、哺乳类等几乎所有生物类群[10]。环境DNA 研究发展概略见图1。

2 环境DNA 应用领域

2.1 物种及物种多样性

目前，国内关于eDNA 技术的运用主要包含常见物种监测，珍稀及濒危物种监测和入侵物种监测。通过利用eDNA 技术，对我国淡水水域中的常见鱼种开展检测，以掌握其资源现状，从而促进中国鱼类资源的保护与发展，对我国各地有效实施渔业增殖放流的管理工作有着重要意义[11]。不同于国外，我国的eDNA 技术起步较晚。王晓辉等[12]从海洋底泥中的提取并纯化eDNA 的研究，为之后eDNA 技术在水生生态系统中进行物种监测的成功应用奠定了基础。卢珊[13]研究萼花臂尾轮虫、鲤、泥鳅和日本沼虾与其eDNA 的定性与定量关系，证实通过对水体中eDNA 的定性、定量测定可以实现对水体中的水生生物种类及生物丰度的监测。刘军等[14]分别对线粒D-loop 区、16S RNA 基因、COI基因以及Cytb 基因部分片段进行扩增，通过与千岛湖48 种鱼类基因组DNA 进行比较后，发现线粒体16S RNA 基因具有更好的通用性和适用性，更适合作为鱼类结构分析eDNA 研究的通用引物。徐念等[15]在长江宜昌至南京江段进行调查，将eDNA技术与传统调查方法所得结果对比发现，eDNA 技术检测出的物种种类为15 种，比传统调查方法少2 种，但其中含有传统方法未检测到的鱼类。罗加山[16]通过eDNA 结合高通量条形码技术，对滇中高原湖泊鱼类多样性进行研究，整理了抚仙湖、阳宗湖、滇池、星云湖4 个湖泊的鱼类分布图及其鱼类物种组成。王桂营[17]应用eDNA 技术，对鸭绿江口底栖生物多样性及评价生态质量状况进行初步研究，并与形态学鉴定结果比较，显示两者所得评价指数间的相关性十分接近。上述研究表明，eDNA技术发展前景广阔，可作为形态学鉴定方法的一种重要补充工具。

2.2 生物量评估

生物量评估是水生生物资源监控中的一项重要任务，通过对原始生态中的eDNA 浓度进行测定和比对，可以实现对监测区域内目标生物量水平高低的监测。近年来，越来越多的科学家通过研究将eDNA 浓度与生物量联系起来，认为eDNA 浓度与生物密度之间存在某种线性关系，即通过检测该环境中的eDNA 浓度，可以估算出物种的生物量[18]。文献[19-20]均在实验室中通过试验得出，eDNA 浓度随着水温的升高呈指数衰减，且eDNA 的浓度与鲤生物量有着明显的正相关关系。Klymus 等[21]进行的试验同样发现，eDNA 的浓度与生物量之间呈正相关，但不同的是，影响eDNA 浓度变化的因素是摄食量而非水温。文献[22-23]研究表明，影响eDNA浓度的因素还包括生物个体的生成速率、生物密度、环境条件（高pH 值、强光、盐度）等。Evans 等[24]对9 种生物的线粒体基因片段序列进行测定研究，发现其序列拷贝数与生物丰度间，存在正相关关系，进一步说明eDNA 具有用于生物量评估的潜力。国内对于eDNA 技术进行生物量评估的研究也在增多。李苗等[25]通过对eDNA 技术的不断研究，总结出一套适用于中国对虾生物量评估的eDNA 技术操作流程，为我国对虾养殖的从业者提供了一种新的方法。闫卉果等[26]同样建立并优化了适用于岩原鲤生物量评估的eDNA 技术，具有快速、灵敏、特异性强等特点，使其在实际应用中成为一个重要的附加工具。秦传新等[27]报道了国外有关eDNA 应用于生物量评估方面的研究进展，指出，与传统方法相比，eDNA 技术具有高效、经济、安全等优势，但也存在着无法直接观察生物群落和个体情况等缺陷，因此，只有将二者融合起来、取长补短，才能更好地为生物量评估工作提供技术支持。

2.3 珍稀物种和入侵物种监测

许多珍稀或濒危鱼类作为其生态系统中不可或缺的一部分，近年来，受人为或自然等因素影响，其种群数量正处在灭绝的边缘。珍稀及濒危鱼类难以捕获且数量稀少，传统方法如水声监测法及刺网监测法等，在监测过程中易对生物造成一定伤害。eDNA 技术具备采样简单、环境友好等特点，在物种数量较少的情况下，对其监测具有重要意义。吴昀晟等[28]利用eDNA 技术，对长江江豚种群进行监测，证明了环境DNA 技术用于监测长江中低密度濒危水生动物的可行性。

物种入侵不仅对本地鱼类会产生一定的威胁，同时对生态系统也会产生巨大危害。在物种入侵前期，其生物量较少，尚未形成种群，及时发现并处理可以有效避免物种入侵所产生的危害。因此，通过eDNA 技术对入侵物种进行监测，是做好生物入侵预防工作的重要保障。

在国外，Jerde 等[29]用eDNA 技术，对芝加哥运河中的2 种亚洲鲤进行早期入侵监测，并将其与传统渔业调查方法比较，结果显示，eDNA 监测敏感度更高。在国内，马竹欣[30]利用eDNA 技术调查元阳梯田中克氏原螯虾分布情况，通过与虾笼诱捕法对比，结果表明，其检出率显著高于传统方法，证明eDNA 技术可以高效监测入侵物种的分布现状及扩散动态等。

3 环境DNA 研究方法

eDNA 技术操作，大致分为3 大部分，即样品的采集与保存、eDNA 捕获与提取、eDNA 分析等。近年来，国内外相继出现有关eDNA 监测技术标准化的报道。针对不同生态系统中，在应用eDNA 监测技术时，存在诸多差异，从而导致试验结果各不相同。因此，eDNA 监测技术标准化系统性框架的建立，具有重大意义。

3.1 样品的采集与保存

在我国，eDNA 技术的应用范围十分广泛，无论是对特定物种监测还是对某区域进行生物量评估，选择合适的方法采集和保存样品，是保证试验数据准确的重要因素。张丽娟等[31]通过对云南滇池和抚仙湖中2 个湖泊中的水样品进行测序，整理出适用于2 个湖泊中藻类监测的测序深度。为减少使用的误差，在取样时从每个点位各采集水样1 L，并进行3 次重复采样。王汝贤等[32]利用eDNA技术，对长江口水域鱼类生物多样性进行调查，同样是18 个采样站点，均使用1 000 mL 的采样瓶，重复采集3 瓶表层水样品，该方法与传统底拖网调查方法获得的结果对比，eDNA 检出率明显提高。为减少对水样的污染，工作人员在采样时，一定要佩戴口罩和手套，同时在采样前，需将采样瓶和采水器润洗，并使用10%漂白剂浸泡10 min，采样时，用纯净水做阴性对照。

样品保存，主要指样品从采集到eDNA 提取这段时间的保存。eDNA 存在于许多样品中，如土壤、沉积物、固体混合物等样品，无须预处理，可以选择在-80 ℃、-20 ℃温度下，干燥冷冻或干冰浴冷冻保存[33]。水样保存，则可以选择冰浴保存，可有效降低eDNA 的降解速率[34]。

3.2 eDNA 捕获

过滤法、沉淀法和离心法，是目前主要使用的捕获eDNA 的3 种方法。其中以过滤法最为常用，且效果要比另外2 种方法好。过滤法是指对水样进行过滤，在水样通过滤膜后，将eNDA 截留在滤膜上。沉淀法原理是利用一定比例的乙酸钠（CH3COONa）和无水乙醇（C2H5OH）与水样反应，使其中的eDNA 聚集并沉淀，从而获得富集eDNA 的沉积物。离心法则是利用离心机，对水样进行离心处理来富集eDNA[35]。

3.3 eDNA 提取

水样中eDNA 含量少，且成分复杂，如重金属离子、腐殖酸以及来自不同生物组织的DNA 片段等，都会导致试验结果出现误差。近年来，越来越多的研究者，将传统方法与DNA 提取试剂盒相结合，提出了多种方法，从样品中提取高质量的水样DNA。

eDNA 提取方法可分为3 大类，分别为传统提取法（过滤法、沉淀法以及物理破碎法等）、DNA 试剂盒提取法，以及两者结合的方法。目前常用的水样eDNA 提取试剂盒有：DNeasy Tissue and Blood DNA extraction kit 、QIAamp DNA Micro extraction kit、MoBio Power Water DNA extraction kit 和QuickgDNA spin-column kit 等4 种试剂盒[36]。水样eDNA提取试剂盒又可分为普通DNA 提取试剂盒与专有eDNA 提取试剂盒。DNeasy Tissue and Blood DNA extraction kit 属于普通DNA 提取试剂盒，MoBio Power Water DNA extraction kit 则属于专有DNA 提取试剂盒。目前尚无文献报道将普通eDNA 试剂盒与专有eDNA 提取试剂盒进行对比试验，但专有eDNA 提取试剂盒的价格相较普通eDNA 试剂盒要更贵。

选择eDNA 提取方法时，要根据不同试验对象选择不同的方法，以获得高质量的水样DNA。Deiner等[37]通过比较3 种不同的环境DNA 提取方法发现，对于真核生物，应该提取细胞色素C 氧化酶Ⅰ基因（COⅠ基因），采用过滤与Qiagen’s DNeasy Blood &Tissue Kit 相结合的方法，而对于水环境中的真菌，则应该采用沉淀与MoBio Power Water DNA extrac tion kit 相结合的方法。eDNA 提取完成后，一般于4 ℃或-20 ℃冰箱保存。

3.4 eDNA 分析

根据eDNA 监测对象及目的，可将扩增引物分为特异性引物和metabarcoding 通用引物。特异性引物通常应用于对特定物种进行监测，包括珍稀物种监测、入侵物种检测及病原监测等，metabarcoding通用引物则更适用于进行生物多样性或生物量评估等[38]。设计引物时，可参考NCBI 等大型开放数据库中的序列或通过测序技术，来获得目标物种的DNA 序列，通用引物扩增片段一般控制在90～120 bp为宜[39]。目前主要使用的引物设计软件有：Primer Premier，NCBI Primer-Blast，Primer3 Plus 等。不同的生物类群所使用的通用引物各不相同，如真菌通常使用18S rRNA 基因作为通用引物，细菌、古菌则采用16S rRNA 基因。在鱼类研究中，主要以12S rRNA基因或CO I 基因作为通用引物。两者各有优势，12S rRNA 基因具有更高的检出率，CO I 基因的数据库则更加全面。

水样本的扩增方式有常规PCR 扩增和实时荧光定量PCR（qPCR）。常规PCR 可利用通用引物扩增多种生物的目的片段；qPCR 可利用特异性引物，定性扩增特定物种的目的片段，同时能定量分析该目的片段的含量[40]。PCR 扩增结果以阴性、阳性记录。采用凝胶电泳法对PCR 扩增结果进行检测，从而推测采样点是否存在目标种的活动迹象，阴性表明环境样品中不存在目标种的DNA，阳性则表明环境样品中存在目标种的DNA[41]。通常研究者会选择采用10～40 μL 的PCR 反应体系、设置3～10 个平行样本的方法，确保结果的准确性，通过设置阴阳性对照，排除假阳性与假阴性扩增以及交叉污染。

4 优势和存在问题

4.1 eDNA 技术的优势

eDNA 技术发展至今已有约30 年，eDNA 技术的研究领域，从微生物生态学拓展到了生态系统生态学、古生态学及生物多样性监测等；检测对象涵盖了微生物、植物、鱼类、哺乳类等生物。从物种多样性研究、生物量评估、入侵物种监测甚至到重建古生态系统、古植物史，eDNA 的应用范围也在不断扩大。eDNA 技术作为一种全新的生物调查方法，同传统调查方法相比，具备灵敏度高、特异性强、操作便捷、受外界影响因素小等显著特点。在使用该种方法进行调查时，能节省人力、物力、财力以及时间，采样时，对生态系统的干扰较小。

4.2 eDNA 技术存在的问题

eDNA 技术虽在以上方面优于传统调查方法，但在目前的诸多研究试验中，仍存在一系列的问题与不足。在采集和保存样品、eDNA 提取及分析等方面，各研究者所采取的方法不尽相同，导致最后与得出的结果之间，均存在一定差异，缺乏对比性。因此建立eDNA 监测方法标准化框架，对eDNA 技术的应用推广十分重要。

eDNA 技术存在PCR 通用引物设计繁锁的潜在局限性，目前的研究水平，尚无十分完美的通用引物。以鱼类多样性检测中常用的12S rRNA 序列为例，在进行PCR 扩增后，得到的片段几乎90%均注释到鱼类中，但其分辨率较低，种属区分度不明显，仍需要加以改进[42]。

在样品采集、保存及运输过程中，极易出现交叉污染，且样品本身可能含有高盐、腐殖酸、重金属离子等PCR 抑制剂，导致试验结果出现假阴性的情况。PCR 扩增及高通量测序时，操作步骤烦琐，使用试剂繁杂，也增加了样品被污染的概率。

目前常用的基因库有NCBI、BLOD 和Mito chondrial Genome Database of Fish 等大型开放数据库，针对一些特定生物类群构建的DNA 数据库，也在不断出现，但在这些国际数据库中，有关中国生物类群的数据，仍存在很大欠缺。赵梦迪[43]在中国东黄海鱼类资源调查时发现，eDNA 技术能够检测到大部分的传统方法捕捞的鱼类，却仍有部分鱼类无法被检测到。

5 展望

环境DNA 技术作为一种快速、精准的生物调查方法，与第二代测序技术（NGS）相结合，极大提高了人类对生态系统中物种信息监测的能力。该方法目前在物种多样性监测、生物量评估、珍稀水生生物资源调查等诸多研究中，展现出了显著优势和巨大潜能。但国内eDNA 技术起步较晚，因此仍有许多问题需进一步研究和解决。在今后的环境DNA研究中，一方面要大力发展并推广eDNA 技术，完善国内数据库；另一方面应尽快制定一个统一的eDNA 监测方法标准化框架。eDNA 技术与传统调查方法各有自己的优势，在实际应用过程中，eDNA技术不能完全取代传统调查方法，要将2 种方法相结合，才能更好地对水生生物进行监测，在水生生态文明建设中发挥更为重要的作用。