APP下载

微囊藻毒素暴露对河川沙塘鳢病理损伤、生化反应的影响

2023-11-20郑友姜虎成张燕李杰周梓涵刘国兴

水产养殖 2023年11期
关键词:河川肝细胞肝脏

郑友,姜虎成,张燕,李杰,周梓涵,刘国兴,*

[1.江苏省淡水水产研究所,江苏 南京 210017;2.江苏省科技资源(农业种质)统筹服务平台重要经济鱼类低温种质库,江苏南京 210017;3.扬州大学动物科学与技术学院,江苏 扬州 225009]

当蓝藻暴发时,会产生不同种类的藻毒素(Microcystins, MCs),严重影响水产养殖动物的安全[1]。在MCs 的众多变体中,微囊藻毒素(LR 亚型)(Microcystin-LR, MC-LR)的毒性最强。MC-LR 在环境中性质极其稳定,且难以被降解,容易通过食物链富集到水生动物体内,最终进入到人体中并造成危害[2-3]。目前MC-LR 在全球不同水体中均有检测到。2008 年,太湖水体中MC-LR 检测质量浓度为11.8 μg/L[4];土耳其科瓦达湖中MC-LR 检测质量浓度为48.5 μg/L[5]。这些浓度都远高于世界卫生组织对饮用水中MC-LR 上限含量的(1 μg/L)规定。

目前,有关鱼类暴露在MC-LR 的研究,多集中在鱼类的免疫[6]、神经[7]和生殖毒性[8]等方面。肠道作为重要的免疫和消化器官,对水生动物的健康有较大的影响[9]。当鱼类暴露在受蓝藻污染的水体中,肠道作为MC-LR 的靶器官[10],直接影响到肠道结构的稳态,最终对机体的健康产生影响。

河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)是一种个体较小、肉食性的淡水底栖鱼类,广泛分布在长江中下游、钱塘江、闽江等水系。近些年来,随着河川沙塘鳢人工养殖技术的逐步成熟,养殖规模不断扩大。当养殖水体暴发蓝藻时,河川沙塘鳢会受到MC-LR 的胁迫。现开展MC-LR 对河川沙塘鳢组织病理损伤、生化反应的影响试验,了解MC-LR对河川沙塘鳢生长和存活的影响,为MCLR 的风险评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 时间与地点

2022 年10 月23 日—11 月9 日。试验地位于江苏省淡水水产研究所扬中基地。

1.2 材料

MC-LR(MC-LR,CAS 101043-37-2, HPLC≥纯度95%)购买于上海源叶生物科技有限公司(中国上海)。将其溶于甲醇,配制质量浓度为250 μg/mL的原液,于-20 ℃冰箱保存。通过向曝气自来水中加入适量的原液,达到MC-LR 处理所需的浓度。

选择体型相近的河川沙塘鳢,体长(11.5±0.9)cm,体质量(25.3±4.0)g,产自江苏扬中养殖基地。在试验前,沙塘鳢在2 个50 L 水箱中驯化2 周,实验室温度(26±2)℃,光暗周期12∶12。驯化和试验期间,均提供饵料。驯化后,将沙塘鳢随机分配到实验室蓝色水箱(60 cm×30 cm×35 cm)。在试验期间,水体盐度为(0.10±0.03)%,pH 值7.0~7.5,温度(26±1)℃。每隔1 d 换1 次水。

1.3 慢性暴露试验

设置3 个试验组(D3、D5、D7)1 个对照组(CK)。选择世界卫生组织微囊藻毒素限定标准值(1 μg/L)的10 倍,作为试验的暴露浓度。试验组在曝气自来水中加入适量的原液,以达到MC-LR 处理所需的浓度(10 μg/L)。对照组中只加入干净的水,不加任何试剂,其余条件与试验组保持一致。每个试验组设置3 个重复组,每个重复组10 条鱼,试验组共9 个重复,90 条鱼。对照组3 个重复,每个重复10 条鱼。

在试验期间,每天更换三分之一的水,以保持水质和适当浓度的MC-LR,其他条件与驯化过程保持一致。在试验开始后的24 h 内,每4 h 观察1 次沙塘鳢中毒症状并记录,同时记录24,48 和96 h 其死亡率。

1.4 样品收集

在采集样品前,禁食1 d,使用三卡因甲磺酸盐(MS222)麻醉河川沙塘鳢,另外,取各组河川沙塘鳢的肠道和肝脏组织,用4%多聚甲醛固定,进行组织病理学检查。用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗肠道3 次,液氮快速冷冻,于-80 ℃冰箱保存,用来测定生化指标。所有采样程序都是在超净工作台上进行。

1.5 生化分析

每组随机取3 尾河川沙塘鳢的肠道组织(n=3),取样量为0.2 g 左右,使用PBS 冲洗血液,快速放入液氮中,并于-80 ℃冰箱保存。测定酶活前,将组织混合生理盐水匀浆(W∶V=1∶9),然后在4 ℃下,于3 500 r/min 离心10 min。分别测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平。

1.6 HE 染色及组织病理学观察

每组随机取3 尾河川沙塘鳢的肠道和肝脏组织,使用PBS 冲洗血液。吸干水分后放入装有4%多聚甲醛的离心管中固定24 h。随后用水冲洗组织,并用分级乙醇系列进行脱水。然后,样品在二甲苯中透明,并包埋在石蜡中。石蜡切片厚度为5 μm,使用旋转切片机(RM2016,莱卡,德国)。脱蜡后切片苏木精-伊红染色。染色切片的显微镜观察和摄影使用显微镜(Eclipse E100,尼康,日本)。

1.7 数据处理与统计分析

采用单因素方差分析(ANOVA)和Waller-Duncan 多重区间检验分析各组间的生化指标,比较组间差异显著。统计分析使用GraphPad 9.0 软件(Graph Pad Software Inc., USA)和SPSS 软件(Ver., 26.0;SPSS Inc., 美国)。结果以(平均值±标准差)表示。P<0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 中毒症状以及死亡率

MC-LR 对河川沙塘鳢的毒性试验结果见表1。由表1 可见,在MC-LR 暴露的3 d,河川沙塘鳢开始出现反应迟钝的现象,玻璃棒触碰后游动正常,各组均未出现死亡。暴露的5 d 后,沙塘鳢开始出现测斜,玻璃棒触碰后游动缓慢,开始出现死亡,死亡率达到16.6%。在暴露的7 d,使用玻璃杯触碰存活的沙塘鳢,部分游动缓慢,部分僵直不动,但是鳃盖仍能缓慢闭合张开。此时沙塘鳢的死亡率达到40%,死亡的沙塘鳢,侧卧在养殖箱底部,皮肤发白,眼球凸起。

表1 MC-LR 对河川沙塘鳢的毒性试验结果

2.2 MC-LR 引起河川沙塘鳢肝脏组织病理损伤

通过HE 染色,10 μg/L MC-LR 暴露不同时间段后,河川沙塘鳢的肝脏组织病理变化见图1(a)(b)(c)(d)。由图1(a)可见,对照组的沙塘鳢的肝细胞结构完整,细胞核呈现深褐色并位于细胞中间,细胞间界限清晰。图1(b)中,暴露的3 d 后,肝细胞间缝隙变大,出现充血。由图1(c)(d)可知,在暴露的5 d 中,肝细胞开始出现核溶解,同时出现粉红色的嗜酸小体。在7 d 时,症状加重。

图1 10 μg/L MC-LR 暴露不同时间段后河川沙塘鳢的肝脏组织病理变化

2.3 MC-LR 引起河川沙塘鳢肠道组织病理损伤

通过HE 染色,10 μg/L MC-LR 暴露不同时间段后河川沙塘鳢的肠道组织病理变化见图2(a)(b)(c)(d)。由图2(a)可见,对照组沙塘鳢的肠道结构正常,肠绒毛完整,隐窝结构无异常。图2(b)中,暴露的3 d 后,肠道黏膜肌层出现空泡。由图2(c)可知,在暴露的5 d 中,肠道的空泡化加重。在图2(d)中,暴露在MC-LR 的7 d 后,隐窝结构出现异常,且仍存在空泡化的情况。

2.4 MC-LR 引起河川沙塘鳢肠道组织抗氧化能力的变化

MC-LR 对河川沙塘鳢肠道T-SOD、CAT 活性和MDA、GPX、GSH 浓度见图3(a)(b)(c)(d)(e)。图中各柱间字母不同,表示组间差异显著(P<0.05),字母相同表示组间差异不显著(P>0.05)。由图3 可见,T-SOD 酶活性呈现显著下降趋势;而CAT 酶活性和MDA、GPX 的浓度呈现先下降后上升的趋势,GSH 的浓度与GPX 酶浓度变化趋势相反。

3 讨论

MC-LR 对大多数水生动物有剧毒,但其毒性对不同水生动物的影响存在一定差异。目前,大多数有关MC-LR 对鱼类的毒理学研究均为急性试验,多采用腹腔注射致死浓度或者亚致死浓度。沈强等[11]通过对白鲢和罗非鱼腹腔注射MC-LR,发现MC-LR 的LD50分别为270 和790 μg/kg。环境暴露作为另一种攻毒方式,可以更好地模拟野外真实环境中大多数鱼类的MC 暴露情况。姜锦林[12]将鲤暴露在10 μg/L 的环境中14 d,发现MC-LR 显著改变了抗氧化酶活的活性及浓度,同时造成了一些病理学损伤,但随着暴露时间的增加,氧化损伤得到了消除。在本试验中,发现MC-LR 对河川沙塘鳢产生了类似的影响,但是随着暴露时间的增加,损伤没有被消除。推断两者试验结果的差别,是由物种差异、个体大小和养殖环境等综合因素造成。

MC-LR 是一种肝毒素,极易在肝脏中累积,影响肝脏的功能[13]。在本试验中,河川沙塘鳢在10 μg/L MC-LR 的暴露下,肝脏的组织结构受到严重破坏。暴露3 d 后,肝脏出现充血症状。随后在5 d 时,肝细胞出现了核溶解现象,表明肝细胞开始出现了凋亡。作为重要的免疫和代谢器官,肝细胞的凋亡,会导致解毒能力下降,最终造成鱼类死亡[14]。在7 d 时,肝细胞出现大量的嗜酸小体,这是由于细胞凋亡时,细胞膜内陷或胞质出芽脱落形成的,这同样也证明了肝细胞的凋亡。

目前,有关MC-LR 对水生动的影响多集中在重要的免疫器官上,而肠道作为河川沙塘鳢体内最早接触MC-LR 的组织,还未被全面的研究。为了探究MC-LR 对肠道影响,同样对肠道进行了组织病理观察。发现,虽然河川沙塘鳢的肠绒毛结构没有受到影响,但是肠道黏膜肌层出现了空泡,这可能是MC-LR 通过肠道上皮屏障或者肠道浆膜渗透后造成的。此外,在暴露的7 d,发现隐窝结构出现异常,这影响了肠道对营养物质的吸收。

为了探究MC-LR 是否会引起肠道的氧化应激,对肠道的几种抗氧化酶进行了测定。试验表明,只有抗氧化酶T-SOD 的活性出现了下降的趋势,这与河川沙塘鳢暴露在溴氰菊酯的变化趋势一致[15]。SOD 可以中和体内氧化应激产生的活性氧(ROS),减少其带来的损害。推测MC-LR 导致肠道组织氧化应激,产生了过量的ROS,而组织为了抵抗氧化应激所产生的SOD,无法完全消除ROS,当氧化与抗氧化的平衡被打破时,组织受到了ROS 的侵害,导致产生SOD 的能力越来越弱,这是T-SOD呈现下降趋势的原因。CAT 酶可以消除H2O2带来的损害。MDA 是脂质氧化的最终产物,MDA 的变化可以反映脂质氧化损伤的程度。在本试验中,CAT酶和MDA 浓度都呈现先下降后上升的趋势,这可能与T-SOD 酶活性的下降有关。GPX 同样是体内重要的过氧化氢分解酶,同时它还是GSH 的底物,催化GSH 变成GSSG,使有毒的氧化物变成无毒的烃基化合物,这对缓解MC 产生的活性氧对组织的损害是极其重要的[16]。本试验中,GPX 酶与抗氧化剂GSH 的变化趋势正相反,这可能是部分GPX 酶参与了GSH 的催化反应,导致GPX 酶浓度减少,从而使GSH 的浓度增多。

4 结论

MC-LR 对河川沙塘鳢具有毒性作用,毒理机制可能是通过产生过量的ROS 影响肠道组织的抗氧化能力,从而引起组织损伤。同时肝组织作为微囊藻毒素的主要靶器官,肝细胞的大量凋亡导致其免疫能力下降,最终导致河川沙塘鳢的死亡。

猜你喜欢

河川肝细胞肝脏
重庆横河川仪有限公司
七种行为伤肝脏
肝脏里的胆管癌
外泌体miRNA在肝细胞癌中的研究进展
肝脏减负在于春
黄龙河川道
小满节感怀
IL-17A促进肝部分切除后IL-6表达和肝脏再生
相约蒲河川
肝细胞程序性坏死的研究进展