微囊藻毒素暴露对河川沙塘鳢病理损伤、生化反应的影响

2023-11-20郑友姜虎成张燕李杰周梓涵刘国兴

水产养殖 2023年11期

郑友，姜虎成，张燕，李杰，周梓涵，刘国兴，*

[1.江苏省淡水水产研究所，江苏南京 210017；2.江苏省科技资源（农业种质）统筹服务平台重要经济鱼类低温种质库，江苏南京 210017；3.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009]

当蓝藻暴发时，会产生不同种类的藻毒素（Microcystins, MCs），严重影响水产养殖动物的安全[1]。在MCs 的众多变体中，微囊藻毒素（LR 亚型）（Microcystin-LR, MC-LR）的毒性最强。MC-LR 在环境中性质极其稳定，且难以被降解，容易通过食物链富集到水生动物体内，最终进入到人体中并造成危害[2-3]。目前MC-LR 在全球不同水体中均有检测到。2008 年，太湖水体中MC-LR 检测质量浓度为11.8 μg/L[4]；土耳其科瓦达湖中MC-LR 检测质量浓度为48.5 μg/L[5]。这些浓度都远高于世界卫生组织对饮用水中MC-LR 上限含量的（1 μg/L）规定。

目前，有关鱼类暴露在MC-LR 的研究，多集中在鱼类的免疫[6]、神经[7]和生殖毒性[8]等方面。肠道作为重要的免疫和消化器官，对水生动物的健康有较大的影响[9]。当鱼类暴露在受蓝藻污染的水体中，肠道作为MC-LR 的靶器官[10]，直接影响到肠道结构的稳态，最终对机体的健康产生影响。

河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）是一种个体较小、肉食性的淡水底栖鱼类，广泛分布在长江中下游、钱塘江、闽江等水系。近些年来，随着河川沙塘鳢人工养殖技术的逐步成熟，养殖规模不断扩大。当养殖水体暴发蓝藻时，河川沙塘鳢会受到MC-LR 的胁迫。现开展MC-LR 对河川沙塘鳢组织病理损伤、生化反应的影响试验，了解MC-LR对河川沙塘鳢生长和存活的影响，为MCLR 的风险评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 时间与地点

2022 年10 月23 日—11 月9 日。试验地位于江苏省淡水水产研究所扬中基地。

1.2 材料

MC-LR（MC-LR，CAS 101043-37-2, HPLC≥纯度95%）购买于上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。将其溶于甲醇，配制质量浓度为250 μg/mL的原液，于-20 ℃冰箱保存。通过向曝气自来水中加入适量的原液，达到MC-LR 处理所需的浓度。

选择体型相近的河川沙塘鳢，体长（11.5±0.9）cm，体质量（25.3±4.0）g，产自江苏扬中养殖基地。在试验前，沙塘鳢在2 个50 L 水箱中驯化2 周，实验室温度（26±2）℃，光暗周期12∶12。驯化和试验期间，均提供饵料。驯化后，将沙塘鳢随机分配到实验室蓝色水箱（60 cm×30 cm×35 cm）。在试验期间，水体盐度为（0.10±0.03）%，pH 值7.0～7.5，温度（26±1）℃。每隔1 d 换1 次水。

1.3 慢性暴露试验

设置3 个试验组（D3、D5、D7）1 个对照组（CK）。选择世界卫生组织微囊藻毒素限定标准值（1 μg/L）的10 倍，作为试验的暴露浓度。试验组在曝气自来水中加入适量的原液，以达到MC-LR 处理所需的浓度（10 μg/L）。对照组中只加入干净的水，不加任何试剂，其余条件与试验组保持一致。每个试验组设置3 个重复组，每个重复组10 条鱼，试验组共9 个重复，90 条鱼。对照组3 个重复，每个重复10 条鱼。

在试验期间，每天更换三分之一的水，以保持水质和适当浓度的MC-LR，其他条件与驯化过程保持一致。在试验开始后的24 h 内，每4 h 观察1 次沙塘鳢中毒症状并记录，同时记录24，48 和96 h 其死亡率。

1.4 样品收集

在采集样品前，禁食1 d，使用三卡因甲磺酸盐（MS222）麻醉河川沙塘鳢，另外，取各组河川沙塘鳢的肠道和肝脏组织，用4%多聚甲醛固定，进行组织病理学检查。用无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗肠道3 次，液氮快速冷冻，于-80 ℃冰箱保存，用来测定生化指标。所有采样程序都是在超净工作台上进行。

1.5 生化分析

每组随机取3 尾河川沙塘鳢的肠道组织（n=3），取样量为0.2 g 左右，使用PBS 冲洗血液，快速放入液氮中，并于-80 ℃冰箱保存。测定酶活前，将组织混合生理盐水匀浆（W∶V=1∶9），然后在4 ℃下，于3 500 r/min 离心10 min。分别测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和还原型谷胱甘肽（GSH）水平。

1.6 HE 染色及组织病理学观察

每组随机取3 尾河川沙塘鳢的肠道和肝脏组织，使用PBS 冲洗血液。吸干水分后放入装有4%多聚甲醛的离心管中固定24 h。随后用水冲洗组织，并用分级乙醇系列进行脱水。然后，样品在二甲苯中透明，并包埋在石蜡中。石蜡切片厚度为5 μm，使用旋转切片机（RM2016，莱卡，德国）。脱蜡后切片苏木精-伊红染色。染色切片的显微镜观察和摄影使用显微镜（Eclipse E100，尼康，日本）。

1.7 数据处理与统计分析

采用单因素方差分析（ANOVA）和Waller-Duncan 多重区间检验分析各组间的生化指标，比较组间差异显著。统计分析使用GraphPad 9.0 软件（Graph Pad Software Inc., USA）和SPSS 软件（Ver., 26.0；SPSS Inc., 美国）。结果以（平均值±标准差）表示。P＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 中毒症状以及死亡率

MC-LR 对河川沙塘鳢的毒性试验结果见表1。由表1 可见，在MC-LR 暴露的3 d，河川沙塘鳢开始出现反应迟钝的现象，玻璃棒触碰后游动正常，各组均未出现死亡。暴露的5 d 后，沙塘鳢开始出现测斜，玻璃棒触碰后游动缓慢，开始出现死亡，死亡率达到16.6%。在暴露的7 d，使用玻璃杯触碰存活的沙塘鳢，部分游动缓慢，部分僵直不动，但是鳃盖仍能缓慢闭合张开。此时沙塘鳢的死亡率达到40%，死亡的沙塘鳢，侧卧在养殖箱底部，皮肤发白，眼球凸起。

表1 MC-LR 对河川沙塘鳢的毒性试验结果

2.2 MC-LR 引起河川沙塘鳢肝脏组织病理损伤

通过HE 染色，10 μg/L MC-LR 暴露不同时间段后，河川沙塘鳢的肝脏组织病理变化见图1（a）（b）（c）（d）。由图1（a）可见，对照组的沙塘鳢的肝细胞结构完整，细胞核呈现深褐色并位于细胞中间，细胞间界限清晰。图1（b）中，暴露的3 d 后，肝细胞间缝隙变大，出现充血。由图1（c）（d）可知，在暴露的5 d 中，肝细胞开始出现核溶解，同时出现粉红色的嗜酸小体。在7 d 时，症状加重。

图1 10 μg/L MC-LR 暴露不同时间段后河川沙塘鳢的肝脏组织病理变化

2.3 MC-LR 引起河川沙塘鳢肠道组织病理损伤

通过HE 染色，10 μg/L MC-LR 暴露不同时间段后河川沙塘鳢的肠道组织病理变化见图2（a）（b）（c）（d）。由图2（a）可见，对照组沙塘鳢的肠道结构正常，肠绒毛完整，隐窝结构无异常。图2（b）中，暴露的3 d 后，肠道黏膜肌层出现空泡。由图2（c）可知，在暴露的5 d 中，肠道的空泡化加重。在图2（d）中，暴露在MC-LR 的7 d 后，隐窝结构出现异常，且仍存在空泡化的情况。

2.4 MC-LR 引起河川沙塘鳢肠道组织抗氧化能力的变化

MC-LR 对河川沙塘鳢肠道T-SOD、CAT 活性和MDA、GPX、GSH 浓度见图3（a）（b）（c）（d）（e）。图中各柱间字母不同，表示组间差异显著（P＜0.05），字母相同表示组间差异不显著（P＞0.05）。由图3 可见，T-SOD 酶活性呈现显著下降趋势；而CAT 酶活性和MDA、GPX 的浓度呈现先下降后上升的趋势，GSH 的浓度与GPX 酶浓度变化趋势相反。

3 讨论

MC-LR 对大多数水生动物有剧毒，但其毒性对不同水生动物的影响存在一定差异。目前，大多数有关MC-LR 对鱼类的毒理学研究均为急性试验，多采用腹腔注射致死浓度或者亚致死浓度。沈强等[11]通过对白鲢和罗非鱼腹腔注射MC-LR，发现MC-LR 的LD50分别为270 和790 μg/kg。环境暴露作为另一种攻毒方式，可以更好地模拟野外真实环境中大多数鱼类的MC 暴露情况。姜锦林[12]将鲤暴露在10 μg/L 的环境中14 d，发现MC-LR 显著改变了抗氧化酶活的活性及浓度，同时造成了一些病理学损伤，但随着暴露时间的增加，氧化损伤得到了消除。在本试验中，发现MC-LR 对河川沙塘鳢产生了类似的影响，但是随着暴露时间的增加，损伤没有被消除。推断两者试验结果的差别，是由物种差异、个体大小和养殖环境等综合因素造成。

MC-LR 是一种肝毒素，极易在肝脏中累积，影响肝脏的功能[13]。在本试验中，河川沙塘鳢在10 μg/L MC-LR 的暴露下，肝脏的组织结构受到严重破坏。暴露3 d 后，肝脏出现充血症状。随后在5 d 时，肝细胞出现了核溶解现象，表明肝细胞开始出现了凋亡。作为重要的免疫和代谢器官，肝细胞的凋亡，会导致解毒能力下降，最终造成鱼类死亡[14]。在7 d 时，肝细胞出现大量的嗜酸小体，这是由于细胞凋亡时，细胞膜内陷或胞质出芽脱落形成的，这同样也证明了肝细胞的凋亡。

目前，有关MC-LR 对水生动的影响多集中在重要的免疫器官上，而肠道作为河川沙塘鳢体内最早接触MC-LR 的组织，还未被全面的研究。为了探究MC-LR 对肠道影响，同样对肠道进行了组织病理观察。发现，虽然河川沙塘鳢的肠绒毛结构没有受到影响，但是肠道黏膜肌层出现了空泡，这可能是MC-LR 通过肠道上皮屏障或者肠道浆膜渗透后造成的。此外，在暴露的7 d，发现隐窝结构出现异常，这影响了肠道对营养物质的吸收。

为了探究MC-LR 是否会引起肠道的氧化应激，对肠道的几种抗氧化酶进行了测定。试验表明，只有抗氧化酶T-SOD 的活性出现了下降的趋势，这与河川沙塘鳢暴露在溴氰菊酯的变化趋势一致[15]。SOD 可以中和体内氧化应激产生的活性氧（ROS），减少其带来的损害。推测MC-LR 导致肠道组织氧化应激，产生了过量的ROS，而组织为了抵抗氧化应激所产生的SOD，无法完全消除ROS，当氧化与抗氧化的平衡被打破时，组织受到了ROS 的侵害，导致产生SOD 的能力越来越弱，这是T-SOD呈现下降趋势的原因。CAT 酶可以消除H2O2带来的损害。MDA 是脂质氧化的最终产物，MDA 的变化可以反映脂质氧化损伤的程度。在本试验中，CAT酶和MDA 浓度都呈现先下降后上升的趋势，这可能与T-SOD 酶活性的下降有关。GPX 同样是体内重要的过氧化氢分解酶，同时它还是GSH 的底物，催化GSH 变成GSSG，使有毒的氧化物变成无毒的烃基化合物，这对缓解MC 产生的活性氧对组织的损害是极其重要的[16]。本试验中，GPX 酶与抗氧化剂GSH 的变化趋势正相反，这可能是部分GPX 酶参与了GSH 的催化反应，导致GPX 酶浓度减少，从而使GSH 的浓度增多。