天竺桂叶精油抑菌活性研究

中国樟科植物资源丰富，主要分布于长江流域南部，四川、广东、广西、江西等分布较多[1]，是集医药用、材用、城市绿化为一体的植物资源[2]。天竺桂（Cinnamomum japonicum Sieb.）属于樟科樟属植物，其枝、干、叶都可提取精油，用来制作各种香料、调料、药物[3]。由于天竺桂枝繁叶茂，生长较快，用作城市绿化树种时，修剪的枝叶常作废物处理，造成大量浪费[4]。大肠杆菌（Escherichia coli）是条件致病菌，可引起各种局部组织器官感染。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiel‐la Pneumoniae）能造成肺部感染，最终恶化为肺炎。鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是医院感染常见的一种细菌，通常会引起各类炎症。植物精油来源于自然环境，使用后不会产生药物残留造成污染[5]。目前，樟属植物精油在杀菌、抑菌方面的研究较为丰富，具有良好的抑菌活性。新木姜子精油对大肠杆菌有着较强的抑制效果[6]。肉桂精油对肺炎克雷伯氏菌有良好的抑制效果[7]，能快速灭杀铜绿假单胞菌[8]。天竺桂精油的抑菌范围广，对金黄色葡萄球菌、黑曲霉、大肠杆菌、甘蓝黑腐菌、普通变形杆菌、藤黄八叠球菌、白菜软腐菌等都有着良好的抑菌效果[9-10]，但抑菌活性强弱差异较大。本研究通过分析天竺桂叶精油的抑菌活性，确定它对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌抑菌活性的强弱，为其植物资源化开发提供基础理论支撑。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1植物材料

天竺桂新鮮树叶采集于四川农业大学成都校区内，用水洗净后装入尼龙网袋，自然晾干待用。

1.1.2供试菌种与培养基

大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella Pneumoniae）、鲍曼不动杆菌（Aci‐netobacter baumannii）菌种均由四川农业大学动物医院提供。细菌的扩大培养和最小抑菌浓度的测定采用肉汤液体培养基进行分析。

1.1.3实验仪器

高温高压灭菌锅MLS-3780、恒温摇床ZWY-2102C、超净工作台VD-850，恒温培养箱等。

1.2实验方法

1.2.1精油提取

将天竺桂树叶粉碎，采用水蒸气蒸馏法提取精油。将天竺桂树叶与蒸馏水按1：4比例装入烧瓶中，蒸馏3 h，再用无水Na2SO4对精油进行干燥，密封避光待用，并计算提取率。

1.2.2精油溶液配置

以三氯甲烷为溶剂，按100%、75%、50%、25%、0%精油体积分数进行精油溶液的配置，五种体积分数的精油溶液每次配置200 L，现配现用。

1.2.3细菌扩大培养

采用恒温摇床对三种细菌扩大培养，转速160 r/min，培养温度37℃，培养时间24 h。对3种菌液浓度采用麦氏比浊法进行测定，测定3种菌液浓度均为3×108/mL。

1.2.4抑菌活性测定

采用打孔法测定精油的抑菌活性。具体步骤为：用移液枪将100 L细菌加入已备好的无菌培养基中，涂布均匀后静置，待培养基完全吸收菌液后，用6 mm直径的无菌打孔器将其打孔，再将50 L精油溶液加入孔中，放入37℃恒温培养箱中。24 h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.5最小抑菌浓度测定

采用96孔板法测定精油的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。吐温80作为溶剂（按吐温80：精油= 1：5）配置精油乳浊液，用二倍稀释法设置精油乳浊液浓度，取6个无菌离心管，依次编号，将300 L精油、60 L吐温80、840 L培养液加入第1个无菌离心管中，摇晃均匀后，将600 L培养液各自加入其余离心管中，再按顺序从前1个离心管中取600 L溶液加入并摇晃均匀。从不同的离心管中，各取20 L乳浊液加入微孔板中，并将160 L培养液和20 L菌悬液加入每个试样中，使每个微孔板中试样的精油浓度分别为10.0000、5.0000、2.5000、1.2500、0.6250、0.3125 L/mL，将仅加入20μL菌悬液和180 uL培养液的微孔试样作为阳性对照，再将96孔板放入37℃恒温培养箱中进行培养，24 h后试样清澈未发现明显细菌生长的浓度为最小抑菌浓度，从清澈透明的试样中取100 L涂布于固体培养基上，24 h后平板上完全无细菌生长的浓度为最小杀菌浓度。

2结果与分析

2.1精油抑菌活性

本研究中，天竺桂叶精油提取率为0.82%。由表1可知，天竺桂叶精油对大肠杆菌抑菌效果最好，100%体积分数的天竺桂叶精油抑菌圈直径可达17.45 mm，25%体积分数的天竺桂叶精油抑菌圈直径也有10.23 mm；对鲍曼不动杆菌抑菌效果较大肠杆菌略差，最大抑菌圈直径13.46 mm，最小抑菌圈直径8.34 mm；对肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最差，最大抑菌圈直径10.12 mm，50%体积分数以下的天竺桂叶精油抑菌效果不明显。

2.2最小抑菌浓度（MIC）

用天竺桂叶精油分别对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌最小抑菌浓度进行测定，其结果详见表2，由表2可知，天竺桂叶精油对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度均为2.5L·mL-1，天竺桂叶精油对肺炎克雷伯氏菌的最小抑菌浓度为5.0L·mL-1，直径达17.45 mm，25%体积分数的天竺桂叶精油抑菌圈直径也有10.23 mm；对鲍曼不动杆菌抑菌效果较大肠杆菌略差，最大抑菌圈直径13.46 mm，最小抑菌圈直径8.34 mm；对肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最差，最大抑菌圈直径10.12mm，50%体积分数以下的天竺桂叶精油抑菌效果不明显。

2.3最小杀菌浓度（MBC）

将最小抑菌浓度实验中的清澈溶液再培养24 h后的结果详见表3，天竺桂叶精油对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的最小杀菌浓度为5.0 L·mL-1，对肺炎克雷伯氏菌的最小杀菌浓度为10.0 L·mL-1。

3结论与讨论

天竺桂叶精油对肺炎克雷伯氏菌有抑菌效果但相对较差，但对大肠杆菌和鲍曼不动杆菌都有着良好的抑菌效果。天竺桂叶精油对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度分别为2.5 L·mL-1、5.0 L·mL-1和2.5 L·mL-1，天竺桂叶精油对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌的最小杀菌浓度分别为5.0 L·mL-1、10.0 L·mL-1和5.0 L·mL-1。与马英姿等人[9]的研究结果相比较，本实验中天竺桂叶精油对大肠杆菌的抑菌圈直径较小，推测原因是抑菌实验方法的不同和精油溶液含量不同，打孔法精油溶液用量为50 L，马英姿等人采用牛津杯法精油溶液用量为200 L。另外，本研究中对大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度与马英姿等人的实验结果相比浓度更高，推测原因是所选溶剂不同，在抑菌圈试验中对肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果稍差，而在最小抑菌浓度和最小杀菌浓度实验中表现尚可，推测原因是两个研究所选溶剂不同。如在黄晓东[10]等人研究中，天竺桂叶精油与青霉素钠等量合用时能够一定程度上的增加青霉素钠的抑菌效果，与硫酸庆大霉素联合用药时却降低了硫酸庆大霉素抑菌效果。申鸽[11]研究表明，当香樟叶与天竺桂叶精油按一定比例进行混合后，对蚊虫的毒杀效果增强，若将这种方法运用在精油抑菌方面，推测会有较好的效果，这对精油抑菌方面具有参考意义，为后续研究提供了新的方向。

参考文献

[1]杨永，刘冰.中国樟科物种编目：问题和展望[J].生物多样性，2015，23（2）：232-236.

[2]刘春生，卢彪，张鹏鹏.重庆地区樟科植物资源调查与应用研究[J].绿色科技，2016（19）：6-8.

[3]陶思兴，王佳玉，罗水平，等.野生天竺桂叶挥发油的抗氧化活性研究[J].北京联合大学学报，2014，28（2）：22-25.

[4]舒康云，陶永元，徐成东，等.天竺桂叶精油的提取及成分分析[J].中南林业科技大学学报，2014，34（1）：107-111.

[5]申鸽，彭映辉，秦巧慧，等.天竺桂叶精油成分分析及其对蚊虫的毒杀作用[J].中南林业科技大学学报，2010，30（9）：132-136.

[6]李娜，李鑫，祝子坪，等.舟山新木姜子挥发性成分的季节性变化及抑菌、抗氧化效果研究[J].林业科技，2018，43（5）：12-15.

[7]Yang SK， Yusoff K， Ajat M， et al. Disruption of KPCproducing Klebsiella pneumoniae membrane via induc‐tion of oxidative stress by cinnamon bark （Cinnamomum verum J. Presl） essential oil[J]. PloS one， 2019， 14（4）： e0214326.

[8]Elcocks ER， SpencerccHillips PTN， Adukwu EC. Rapid bactericidal effect of cinnamon bark essential oil against Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of applied microbiology， 2020， 128（4）： 1025-1037.

[9]马英姿，谭琴，李恒熠，等.樟树叶及天竺桂叶的精油抑菌活性研究[J].中南林业科技大学学报，2009，29（1）：36-40.

[10]黃晓东，黄晓昆，张娴，等.天竺桂叶精油的含量动态、化学成分及体外抗菌活性[J].中国农学通报，2010，26（4）：182-188.

[11]申鸽.十一种植物精油及其混剂对致倦库蚊的熏蒸活性研究[D].中南林业科技大学，2012.

基金项目：彩叶树种资源开发及在龙泉山的应用研究（21LQ03）；桢楠根腐病原菌与生防细菌鉴定以及对植株的抗性生理指标分析（23ZR201）

【1成都农业科技职业学院特色花木研究所李凤，唐敏（通讯作者）；2四川农业大学林学院张优】