8种食品水提液的抗氧化和抗炎活性比较

杨 红 唐 莉 李 毅 原红霞 李青山,

(1. 山西中医药大学中药与食品工程学院,山西 晋中 030619;2. 山西医科大学药学院,山西 晋中 030619)

随着社会竞争的日趋激烈、行为和生活方式的改变以及环境污染等因素的影响,亚健康人群呈逐年上升趋势[1]。亚健康的形成与氧化应激密切相关,而机体内氧化应激稳态的失衡被看作是形成亚健康的主要机理之一。与此同时,慢性炎症是“亚健康”的加速剂,其持续存在会导致慢性疾病发生发展,通过合理饮食可以缓解亚健康状态,提高生活质量及疾病的预防[2]。

黑米、黑豆、黑芝麻隶属于黑色食品范畴,富含蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素等成分,具有延缓衰老与增强造血功能等生物活性。已有研究显示,黑米的总抗氧化能力是普通稻米的4～18倍[3];黑豆的抗氧化能力远大于黄豆和绿豆[4];黑芝麻籽及黑芝麻皮的总抗氧化能力均高于白芝麻[5]。因此,具有保健功能的黑色食品较其他食品呈现出较高的生物学价值,已成为食品市场的重要分支。目前,有关该类食品的研究范畴有限,有关黑木耳、黑玉米及黑枣的相关研究较少,且尚以抗氧化研究为主,其抗炎活性未见报道。

小米中富含蛋白质和维生素等物质[6],是优质的粮食。燕麦因其丰富的膳食纤维而具有降血脂、促排泄等功效[7]。目前针对小米与燕麦的研究仍集中在其主要功效方面,对抗氧化与抗炎活性的报道较少。

为了进一步比较黑色食品与非黑色食品在生物学功能上的差异,研究拟以黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑枣、黑玉米6种黑色食品为研究主体,与燕麦、小米2种最常见的非黑色食品进行对比,测定8种食品水提液中总黄酮和总多酚含量、抗氧化活性及其抗炎活性,通过分析其相关性,为上述食品的功效研究及其相关功能食品的创新开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑枣、黑玉米、燕麦、小米:市售;

葡萄糖标准品、没食子酸标准品、芦丁标准品:纯度≥98.0%,成都曼斯特生物科技有限公司;

福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):上海麦克林生化科技股份有限公司;

脂多糖(LPS):北京索莱宝科技有限公司;

NO试剂盒:上海碧云天生物技术有限公司;

小鼠IL-6 ELISA试剂盒:武汉贝茵莱生物科技有限公司;

可见分光光度计:DU700型,美国Beckman公司;

二氧化碳恒温培养箱:CCL-170B-8型,新加坡ESCO科技有限公司;

生物安全柜:AC2-4S1型,新加坡ESCO科技有限公司;

荧光酶标仪:SpectraMaxI3x型,美国Molecular Devices仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 8种食品水提液的制备 将黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑枣、黑玉米、燕麦和小米样品经过筛选、粉碎、过筛后,与蒸馏水按照料液比(m样品∶V水)1∶10 (g/mL)于85 ℃提取,过滤,于4 ℃保存备用。

1.2.2 总黄酮含量测定 以芦丁为标准品,采用亚硝酸钠—硝酸铝法[8]。

1.2.3 总多酚含量测定 以没食子酸为标准品,采用Folin-酚法[9]。准确移取样品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,按标准曲线制备的各项操作, 测定吸光度,对照标准曲线,计算样品的总多酚含量。

1.2.4 DPPH自由基清除能力测定 向具塞试管中加入2 mL待测液和2 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L),摇匀,37 ℃避光保存30 min,测定517 nm处吸光度。取2 mL乙醇与2 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol/L)混匀,测定吸光度;取2 mL待测液与2 mL乙醇混匀,测定吸光度。选取维生素C(0.5 mg/mL)作为阳性对照,并按式(1)计算DPPH自由基清除率[10]。

(1)

式中:

R——自由基清除率,%;

A0——空白组吸光度;

A1——样品组吸光度;

A2——对照组的吸光度。

1.2.5 羟自由基清除能力测定 向试管中加入2 mL FeSO4溶液(6 mmol/L)、2 mL H2O2溶液(6 mmol/L)、2 mL水杨酸溶液(6 mmol/L)和2 mL待测液,37 ℃反应1 h,测定517 nm处吸光度。以蒸馏水作为空白对照,以不含H2O2的待测液为对照组,选取维生素C(0.5 mg/mL)作为阳性对照,并按式(1)计算羟自由基清除率[11]。

1.2.6 铁离子还原能力测定 取2.5 mL待测液依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.6)、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液,混匀,50 ℃水浴20 min后迅速冷却,加入2.5 mL 10%三氧乙酸(TCA)溶液,混匀,4 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混匀后静置10 min,测定700 nm处吸光度。以维生素C(0.5 mg/mL)作为阳性对照,还原能力以吸光度值表示。

1.2.7 RAW264.7细胞存活率测定 取对数期小鼠巨噬细胞RAW264.7,接种于96孔板中,37 ℃、5% CO2恒温培养12 h,分别加入100 μL 8种食品水提液,使每个样品孔的终质量浓度为5 mg/mL。37 ℃培养24 h,每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT,37 ℃培养4 h,弃去培养基,加入150 μL DMSO,避光震荡摇匀,测定490 nm处吸光度值,并按式(2)计算细胞存活率。

(2)

式中:

S——细胞存活率,%;

A0——空白组吸光度;

A1——样品组吸光度;

A2——模型组吸光度。

1.2.8 RAW264.7细胞液中NO含量测定 取对数生长期细胞接种于96孔板中,模型组加入100 μL终质量浓度为1 μg/mL的LPS;样品组分别加入100 μL同浓度的LPS和8种食品水提液,使样品终质量浓度为5 mg/mL;阳性药组加入100 μL同浓度的LPS和姜黄素溶液,使阳性药终浓度为25 μmol/L。37 ℃孵育24 h,吸取50 μL上清液,加入50 μL的Griess A、Griess B试剂,测定540 nm处吸光度值,并计算细胞液中NO含量。

1.2.9 RAW264.7细胞液中IL-6含量测定 将细胞上清液于4 ℃离心10 min(3 000 r/min),按照IL-6 ELISA试剂盒操作说明测定细胞液中IL-6含量。

1.3 数据统计分析

所有试验均重复3次,表示为平均值±标准差,采用SPSS 26.0统计软件进行显著性差异分析及组间相关性分析(单因素ANOVA检验)。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量比较

以芦丁质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为Y=0.001 3X+0.003 9(R2=0.998 8),符合比尔定律,可用于总黄酮含量测定。由图1可知,黑枣与黑米的总黄酮含量最高且无显著性差异;黑豆与小米的次之,二者也无显著性差异;黑玉米和黑木耳的黄酮含量较低。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2 总多酚含量比较

以没食子酸质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为Y=0.011 9X-0.02(R2=0.996 7),符合比尔定律,可用于总多酚含量测定。由图2可知,黑豆与黑枣的总多酚含量最高,显著高于其总黄酮含量;其次为黑米,与总黄酮含量相当;小米的总多酚含量与总黄酮相当,但黑玉米的总多酚含量明显高于总黄酮;黑木耳的总多酚含量仅为0.083 mg/g。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3 抗氧化能力比较

2.3.1 DPPH自由基清除能力 以维生素C作为阳性对照,当其质量浓度为0.5 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率高达98.56%,证明试验方法可行。由图3可知,当样品质量浓度为1 mg/mL时,黑枣的DPPH自由基清除能力最高达89.48%,且与其他各组相比有显著性差异。其次是黑米,其清除率为53.69%。黑玉米和黑芝麻也呈现出一定的抗氧化活性,其清除率分别为45.27%,41.56%。而作为非黑色食品的小米和燕麦的DPPH自由基清除率最低,仅为18.41%和22.74%。DPPH自由基活性高低与总黄酮、总多酚含量基本一致,但黑玉米的却呈现较高活性,可能与其含有大量的具有强DPPH自由基清除能力的花青苷色素有关[12]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3.2 羟自由基清除能力 质量浓度为0.5 mg/mL的维生素C溶液对羟自由基的清除率为50.51%,证明试验方法可行。由图4可知,羟自由基清除能力由高到低排序为黑枣>小米>黑豆>黑木耳>燕麦>黑米>黑芝麻>黑玉米。当样品质量浓度为8 mg/mL时,黑枣对羟自由基的清除率为47.37%,而DPPH自由基清除率不佳的小米,其活性与黑枣的相当,达46.46%,二者之间无显著性差异,可能是因为小米富含水溶性膳食纤维,其清除羟自由基的能力强于DPPH[13]。总黄酮、总多酚含量较少的黑木耳,其羟自由基清除能力却较好,可能与曹慧馨等[14]发现的具有较高羟自由基清除活性的黑木耳多糖有关。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3.3 铁离子还原能力 质量浓度为0.5 mg/mL的维生素C溶液对铁离子的还原能力为0.701 4,证明试验方法可行。由图5可知,铁离子还原能力由高到低排序为黑枣>黑米>小米>黑豆>黑芝麻>黑玉米>燕麦>黑木耳,与总黄酮含量排序基本保持一致,与何国云等[15]的研究结果一致。同时,作为非黑色食品的小米表现出优于其他食品的还原能力。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4 抗炎能力比较

2.4.1 对RAW264.7细胞存活率的影响 由图6可知,当食品水提液质量浓度为5 mg/mL、姜黄素为25 μmol/L时,其对细胞活力无显著抑制作用。根据细胞存活率结果,8种食品水提液可使用5 mg/mL这一质量浓度进行后续细胞试验。

图6 8种食品水提液对RAW264.7细胞存活率的影响

2.4.2 对LPS诱导的RAW264.7细胞液中NO含量的影响 以姜黄素作为阳性对照,当其质量浓度为25 μmol/L时,NO抑制率达60.12%,证明试验造模成功且方法可行。由图7可知,当样品质量浓度为5 mg/mL时,黑枣与黑米的NO抑制率最强,达64.92%,60.15%,且黑枣的NO抑制率显著大于黑米的(P<0.05)。其次为黑豆,其NO抑制率为44.95%。同时,黑芝麻、燕麦、黑木耳和小米也表现出一定的NO抑制活性。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4.3 对LPS诱导的RAW264.7细胞液中IL-6含量的影响 当姜黄素浓度为25 μmol/L时,其IL-6抑制率为50.16%,证明试验造模成功且方法可行。由图8可知,当样品质量浓度为5 mg/mL时,黑枣的IL-6抑制率高达78.62%,显著高于其他组(P<0.05)。其次为黑米与黑豆,分别为64.87%,56.98%,其活性趋势与NO抑制率基本一致。IL-6抑制率活性由高到低排序为黑枣>黑米>黑豆>小米>黑芝麻>黑玉米>黑木耳>燕麦,与总黄酮、总多酚含量排序基本一致,其中小米因其富含特有的醇溶蛋白肽而呈现出良好的抗炎活性[16]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.5 总黄酮、总多酚含量与抗氧化、抗炎活性之间的相关性

利用SPSS 26.0统计软件对8种不同食品的总黄酮、总多酚含量及其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、铁离子还原能力、NO抑制率和IL-6抑制率之间进行双变量相关性分析,所得Pearson相关系数及双侧显著性检验结果见表1。

表1 8种食品水提液的总多酚、总黄酮含量与抗氧化、抗炎活性之间的相关性†

由表1可知,8种食品水提液的总黄酮含量与总多酚含量呈显著正相关(P<0.05);总黄酮和总多酚含量与DPPH自由基清除能力、羟自由清除能力和铁离子还原能力呈正相关,其中与还原能力之间的相关性最高(P<0.01)。同时,总黄酮、总多酚含量与NO、IL-6抑制率之间呈极显著正相关(P<0.01),表明多酚和黄酮是其发挥抗氧化和抗炎活性的主要物质基础。同时,8种食品的抗氧化活性与抗炎活性也呈正相关。

3 结论

通过对比研究了黑米、黑豆、黑芝麻、黑木耳、黑枣、黑玉米、燕麦、小米8种食品水提液的总黄酮、总多酚含量与抗氧化、抗炎活性的相关性。结果表明,8种食品水提液均含有总黄酮和总多酚,且含量差异较大,其抗氧化能力与抗炎能力亦存在一定的差异,且总黄酮、总多酚含量与抗氧化、抗炎活性之间存在一定的相关性。总体上,黑枣的总黄酮和总多酚含量最高,黑枣的自由基清除力最强,其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和铁离子还原能力分别为89.48%,47.37%和0.331 6。同时,黑枣对NO和IL-6亦表现出较强的抑制活性。

综上,黑枣含有丰富的黄酮类和多酚类物质,并具有较强的抗氧化、抗炎活性,相比其他食品具有显著性优势。对于开发程度尚不高的黑枣,需进一步深入研究其活性成分及功效。