可注射、组织黏附性PVA/淀粉水凝胶对力学失稳条件下关节软骨退变抑制作用的研究*

张林# 吴康# 褚凤成 唐子牛 刘慧玲 林潇* 杨磊，2*

骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种慢性退行性疾病[1]。目前，研究认为关节内注射透明质酸（hyaluronic acid,HA）可在短期内恢复关节滑液的流变学性能，减轻患者的疼痛症状[2]。然而炎症使得HA快速降解，改变了滑液固有的流变学特性，增加了关节软骨磨损的发生几率[3]。研究发现，高分子量HA表现出比中/低分子量更有效的治疗效果，可能是由于高分子量HA 具有更适宜的流变学性能和抗降解特性[4]。然而，HA制剂仍无法适配正常关节滑液的流变学性能，以及存在降解速率较快等临床应用的局限性。因此，亟需开发一类仿生正常关节滑液流变学性能、降解速率较慢且高生物相容性的可注射材料用于延缓骨关节炎关节软骨的退变。

前期研究中发现控制淀粉和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）的分子结构，以及在基体中添加特定的无机盐可在大范围内调节凝胶的流变学特征[5-7]。本研究采用淀粉、PVA和氯化钠（NaCl）为主要成分制备水凝胶，制备出接近正常关节滑液流变学特征的可注射凝胶材料，进而研究改善骨关节炎关节滑液的流变学特征对力学失稳下关节退变的抑制作用，以期在未来单独或与HA 联合应用于骨关节炎等关节软骨病变的临床治疗。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

聚乙烯醇（PVA，上海国药集团化学试剂有限公司）、蜡质玉米淀粉（Waxy，河南建杰实业有限公司）、氯化钠（NaCl，美国Sigma公司）、DMEM/F-12培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）、磷酸盐缓冲溶液（PBS，武汉普诺赛生命科技有限公司）、胎牛血清（FBS，美国Gibco 公司）、一次性注射器（江苏正康医疗器械有限公司）、流变仪（AR2000，美国TA.Instruments 公司）、红外光谱仪（VERTEX80，德国布鲁克公司）、X射线衍射仪（Empyrean，荷兰帕纳科公司）、Micro-CT（Skyscan，德国布鲁克公司）、显微镜及成像系统（德国Carl Zeiss公司）、万能力学试验机（HY1080，上海衡翼精密仪器有限公司）、全波长酶标仪（美国Biotek 公司）、医用透明质酸钠（HA，日本生化学株式公社）、CCK-8（日本Dojindo 公司）、活/死细胞染色试剂盒（日本Dojindo 公司）、番红快绿染色试剂（美国Sigma公司）。

1.2 水凝胶的制备

在95℃条件下，配置1 wt%的PVA 溶液。待溶液冷却后加入10 wt%的蜡质玉米淀粉（Waxy）和5 wt%的NaCl，搅拌至所有溶质完全溶解后，继续升温至95 ℃搅拌30 min。将上述处理后所得透明预混合凝胶于-80 ℃冷冻10 h，室温融化2 h，反复冻融循环3次，即可得到可注射、组织黏附性水凝胶PWN（PVA/Waxy/NaCl）。

为了研究制备过程中水凝胶的化学结构和相组成的变化，同时制备纯PVA 水凝胶及PVA/Waxy（PW）水凝胶。在95 ℃条件下，配置1 wt%的PVA溶液，将所得的PVA溶液按上述步骤冻融循环3次，得到PVA水凝胶。在95 ℃条件下，将1 wt%的PVA 溶液加入10 wt%的蜡质玉米淀粉搅拌至所有溶质完全溶解后，继续升温至95 ℃搅拌30 min，得到的透明凝胶按上述操作反复冻融循环3 次，得到PW水凝胶。

1.3 PWN的成分表征与材料学性能测试

1.3.1 PWN的成分表征和相组成分析

采用红外光谱仪测定制备过程中三种水凝胶样品的傅里叶变换衰减全反射红外光谱，以分析制得的水凝胶样品中的主要官能团，扫描范围为500～ 4 000 cm-1，扫描精度为4 cm-1。使用X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD）测定三种水凝胶样品的晶体衍射谱图以分析制得的水凝胶样品的相组成，扫描范围为10°～ 50°，扫描速度为5°/min。

1.3.2 PWN的流变学性能测试

本测试采用直径为20 mm、角度为1°的锥板，将水凝胶样品的直径和厚度调整为20 mm和37 μm。流变学性能测试选用振荡模式。在37 ℃、1%应变下进行频率扫描测试，频率范围：0.1～ 10 Hz。剪切稀释性能在37 ℃、0.01～ 1 000（1/s）的剪切速率下测试。自愈合性能测试在37 ℃、1 Hz频率下，1%和500%交替应变下进行时间扫描。

1.3.3 PWN的注射性能测试

将复合淀粉水凝胶装到胰岛素针（32G）注射器中，固定在力学实验机上，以10 mm/min 的恒定速度推注，直到以恒定的力值将水凝胶推出时结束实验，记录PWN水凝胶在推注过程中的推注力随时间变化曲线。

1.3.4 PWN降解性能体外测试

采用模拟关节滑液[8]（含有3 g/L HA 的PBS 溶液）浸泡的方法测试PWN水凝胶的体外生物降解性能。分别在第7、14、21、28 d 时间点，测试浸泡不同时间后PWN 水凝胶样品重量的变化，并计算其相对于原始水凝胶样品重量损失的百分比，将其定义为水凝胶的降解率。

其中，A0是复合淀粉水凝胶初始重量，Ai是浸泡不同时间时所测得的复合淀粉水凝胶重量。

1.3.5 PWN组织黏附性能测试

通过将两片新鲜猪皮固定于力学测试仪的上下夹具中，取0.1 mL 样品置于下夹具猪皮表面。通过移动上夹具，直至上下猪皮与样品接触并产生0.1 N的压力。待压力松弛至0 N 后，以10 mm/min 的速度分离上下猪皮，记录数据，将分离过程中的最大应力定义为界面强度。重复三次实验。

1.4 PWN的体外细胞相容性及抗细菌黏附性能测试

1.4.1 细胞相容性实验

使用Ⅱ型胶原酶对大鼠软骨序贯消化获得大鼠软骨细胞[9]。

CCK-8 增殖实验：取P2 代的大鼠软骨细胞接种于96孔板中。培养第1、3 d时，加入100 μL的CCK-8工作液避光孵育。2 h 后于全波长酶标仪上测定450 nm 处的吸光度值。每组重复3次，每次5个复孔。然后根据如下公式计算细胞的相对增殖率（relative growth rate,RGR）：

其中，P是实验组吸光度，P0是对照组吸光度。

活/死细胞染色：将软骨细胞按2×105个/孔种植在24孔板内培养1和3 d。到计划时间点后，加入活/死细胞染色试剂，避光室温孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.4.2 PWN的抗细菌黏附性能测试

在37 ℃恒温摇床中，将金黄色葡萄球菌（S.aureus）在30 mL LB培养基中孵育过夜。使用LB培养基将过夜孵育的金葡菌菌液稀释1 000倍，预先将PWN、HA紫外线处理消毒，并将消毒后0.5 mL的PWN、HA加入无菌24孔板中。取1 mL稀释后的金葡菌菌液滴加到PWN与HA表面，37 ℃孵育4 h后，使用1 mL细菌染色试剂避光孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.5 体内动物实验

1.5.1 大鼠膝关节软骨退变模型的构建

本实验经过苏州大学伦理委员会批准（SUDA2021121 5A01），所需动物从苏州大学动物实验中心购买。取12只300 g 的SD 雄性大鼠，2%戊巴比妥钠溶液（1 mL/kg）麻醉，右下肢局部备皮消毒后，膝外侧髌骨旁切口入路，切除右膝内侧部分半月板和前交叉韧带，诱导关节失稳从而诱导关节软骨退变的发生，以正常左膝关节作为对照处理，视为假手术组（Sham 组）。逐层缝合膝关节，术后允许动物自由活动。术后1 周，将大鼠分为3 组，未治疗组（Non-treated 组，n=4），透明质酸治疗组（HA 组，n=4）和PWN 水凝胶治疗组（PWN 组，n=4）。处理后4 周，对实验大鼠分别进行安乐死，并对大鼠双侧膝关节取材，加入体积分数10%甲醛溶液固定24 h。

1.5.2 Micro-CT扫描

所有关节标本采用Skyscan Micro-CT 设备进行扫描分析，具体步骤如下：将固定后的膝关节样本置于Micro-CT的标本管中，扫描厚度7 μm，三维重建后分析内侧胫骨平台软骨下骨的骨矿化密度值（bone mineral density,BMD）和骨体积/组织体积比（bone volume/tissue volume,BV/TV）。最后，选取共50层内侧胫骨软骨下骨的矢状面图像，进行观察分析。

1.5.3 组织包埋切片及番红快绿染色

将固定后的组织在10%的EDTA 溶液中浸泡脱钙。梯度脱水后进行石蜡包埋并切成6 μm厚度的薄片。石蜡切片后进行番红快绿染色并用关节显微镜进行观察记录，最后参考骨性关节炎研究学会（OARSI）组织学评分标准进行评分[10]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较时采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水凝胶的化学结构与相组成

水凝胶的红外光谱结果如图1A 所示，单纯的PVA 水凝胶中的O—H 与C—O 分别在3 357.5 cm-1和1 091.5 cm-1处发生伸缩振动；相比之下，由于PVA与淀粉之间可能存在氢键的作用，PW 分子结构中O—H 与C—O 的特征吸收峰分别轻微地红移至3 349.7 cm-1和997.0 cm-1，而PWN 中O—H 与C—O 的特征吸收峰也分别红移至3 338.1 cm-1和997.0 cm-1。水凝胶的XRD 谱图结果如图1B 所示，PW 水凝胶主要的晶体衍射峰处于16°～ 25°之间，与PVA 水凝胶一致，说明PW水凝胶与PVA水凝胶具有相同的相组成；由于NaCl的加入，PWN水凝胶在16°～ 25°范围内的晶体衍射峰强度较低，而在31°～ 33°与44°～ 47°的范围内表现出了较强的晶体衍射，均属于NaCl的晶体衍射峰。

图1 水凝胶的化学结构与相组成：A.PVA、PW与PWN水凝胶的红外光谱图；B.PVA、PW与PWN水凝胶的XRD谱图

2.2 水凝胶的流变学特征

PWN水凝胶与HA的流变学测试结果显示（见图2A），当震荡频率为0.5 Hz，PWN的G'为12.82 Pa，G''为7.51 Pa；而HA 的G'为4.68 Pa，G''为9.81 Pa。当震荡频率提高至2.5 Hz，PWN 的G'为21.76 Pa，G''为13.60 Pa；而HA 的G'为34.59 Pa，G''为23.36 Pa。

图2 PWN的流变学性能：A.PWN和HA在37 ℃、1%应变下的Gʹ和Gʹʹ值随频率的变化曲线；B.PWN在37 ℃时Gʹ和Gʹʹ值随应变的变化曲线；C.PWN在1%和500%交替应变作用下的时间扫描；D.PWN和HA在剪切速率为0.01～ 1 000 s-1时的黏度变化曲线

应变扫描结果如图2B所示，在0.01%～ 300%的应变范围内，PWN 的Gʹ大于Gʹʹ；而在300%至1 000%的应变范围内，Gʹʹ大于Gʹ。PWN 在1%和500%交替应变作用下的时间扫描结果显示（见图2C），当PWN 处于1%的应变时，其Gʹ大于Gʺ；当应变增加到500%时，Gʹ急剧下降，且低于Gʹʹ；当应变再次恢复至1%时，Gʹ再次大于Gʺ，Gʹ与Gʺ恢复至接近初始值。

PWN 和HA 在不同剪切速率下的黏度测试结果显示（见图2D），PWN 和HA 的零剪切速率黏度（剪切速率为0.01 s-1时的黏度）分别为360.99 Pa∙s 和6.05 Pa∙s。同时，随着剪切速率从0.01 增加至1 000 s-1，PWN 与HA 的黏度均逐渐降低，且分别降低至0.51 Pa∙s和0.26 Pa∙s。

2.3 水凝胶的可注射性能、组织黏附性能及降解性能

推注力测试结果显示（见图3A），PWN在通过32G针头时的推注力约为9 N。PWN与HA的拉脱界面强度和界面韧性如图3B所示，PWN沿着分离方向呈现拉丝状变形；相反，HA在分离过程中几乎无形变，能量消耗较少。同时，PWN 的拉脱界面强度为（672.96±229.28）Pa，显著高于HA 的拉脱界面强度（226.20±51.74）Pa（P＜0.05），且PWN的界面韧性也显著高于HA，为HA的（3.80±0.94）倍（P＜0.01，见图3C、3D）。此外，材料在猪关节内摩擦实验结果显示，PWN 黏附于猪软骨表面进行1 000 次循环运动后，仍然可见明显驻留，而HA几乎无驻留（见图3E）。定量分析结果显示，PWN在猪软骨内驻留量约为0.038 g/cm2，显著高于HA的驻留量0.015 g/cm2（P＜0.01，见图3F）。

图3 PWN的注射性能、组织黏附性能和降解行为：A.PWN的推注力—位移曲线；B.HA和PWN与猪皮分离过程；C、D.HA、PWN与猪皮分离过程中的界面强度和界面韧性；E.循环运动后，猪膝关节表面HA与PWN的驻留量图片；F.单位面积猪膝关节表面HA与PWN的定量分析；G.PWN在模拟关节滑液中浸泡28 d后质量损失率随时间的变化

PWN的体外降解测试结果显示（见图3G），水凝胶的降解速度呈现近似匀速的降解行为，在第28 d时PWN的质量损失率为76.5 wt%。

2.4 PWN的细胞相容性及抗细菌黏附性能

CCK-8 实验结果显示，PWN 和HA 的浸提液均能支持软骨细胞的存活，且两组均表现出与对照组相当的相对增殖率（见图4A）。活/死细胞染色结果显示，在培养1 d与3 d 时，PWN 和HA 组均未见明显死细胞（见图4B）。细菌黏附实验结果显示，材料与金黄色葡萄球菌共培养4 h 后，PWN 表面黏附的细菌明显少于HA 和PW（见图4C）。

图4 PWN的细胞相容性和抑菌性能：A.软骨细胞在HA与PWN浸提液中培养1 d和3 d的相对增殖率；B.软骨细胞在HA与PWN浸提液中培养1 d和3 d的活/死细胞染色照片；C.HA、PW与PWN表面黏附金黄色葡萄球菌的荧光染色照片

2.5 大鼠膝关节力学失稳模型中关节腔内注射PWN对软骨及软骨下骨退变的影响

在PWN 和HA 进行关节内注射治疗4 周后，Micro-CT三维重建结果显示（见图5A），PWN组软骨下骨空腔的大小和骨赘均显著小于OA 组和HA 组。大鼠膝关节软骨下骨Micro-CT统计分析结果显示（见图5B），未治疗组大鼠膝关节的软骨下骨的BMD和BV/TV均显著低于正常组（P＜0.01）；同时，HA 组软骨下骨的BMD和BV/TV相比于OA组，差异无统计学意义（P＞0.05）；相比之下，PWN组软骨下骨的BMD和BV/TV均显著高于未治疗组和HA组（P＜0.05）。

图5 大鼠软骨下骨的影像学分析结果。A.4周时大鼠膝关节软骨下骨的Micro-CT三维重建图像（红色箭头指示为骨赘）；B.4周时大鼠膝关节的BMD和BV/TV结果

番红快绿染色结果显示（见图6A），正常组膝关节内侧关节软骨表面光滑完整，软骨表面蛋白聚糖分布范围较广；相比之下，未治疗组软骨表面连续性较差，软骨表面破损、侵蚀严重，软骨细胞数量较少，蛋白聚糖分布范围较窄；HA 组软骨蛋白聚糖分布与正常组相当，但软骨表面凹凸不平、连续性差；相比之下，PWN组软骨表面连续性较好，未见明显破损、侵蚀，蛋白聚糖分布丰度接近正常组。此外，骨性关节炎研究学会（OARSI）评分结果显示（见图6B），未治疗组评分最高，显著高于正常组（P＜0.01）；HA组评分尽管显著低于未治疗组，但仍显著高于正常组（P＜0.01）；而PWN组评分显著低于未治疗组和HA 组（P＜0.05），且接近正常组。

图6 治疗4周后大鼠膝关节的组织学形貌与OARSI评分：A.大鼠OA模型治疗4周后组织的番红O-快绿染色；B.大鼠OA模型治疗4周后组织修复的OARSI组织学评分结果

3 讨论

3.1 骨关节炎时关节滑液力学性能变化及其对力学环境影响、潜在修复策略

由于骨关节炎患者关节内HA酶对HA的降解作用，使得关节滑液的流变学性能改变，可能是HA 临床治疗效果不明确的一个重要原因[11]。Calvet 等[12]通过对骨关节炎患者注射具有不同流变学特征的HA，研究发现关节内注射高分子量（高剪切模量）HA 能更有效地减轻骨关节炎患者的疼痛，表明关节内注射水凝胶的流变学特征可影响其抑制骨关节炎进展的效果。为了解决HA 快速降解的问题，Cai 等[13]合成了一种流变学特征和降解速率可控的可注射HA-聚乙二醇水凝胶，相较于HA 注射治疗，其表现出抑制骨关节炎软骨退变的能力。因此，开发一类仿生正常关节滑液流变学特征、降解速率较慢且具有高生物相容性的可注射材料有望用于关节腔注射治疗，延缓骨关节炎关节软骨的退变。

3.2 淀粉和离子对PVA水凝胶流变学特征的调控作用

PVA 水凝胶具有良好的生物相容性及生物可降解性，Wu 等[14]通过在PVA 水凝胶中引入各种离子，实现了其广泛的力学动态调控特性。此外，淀粉作为一种高分子多糖，可作为增稠剂影响水凝胶的流变学特征[15]。因此，将离子与淀粉引入PVA水凝胶中有望调控其流变学特征。此外，HA 分子的减少，导致关节高负荷区域磨损增加，促进了关节软骨的退变[11]。已有研究显示PVA溶液可吸附在物体表面上形成润滑层[16]。Chen等[17]通过对PVA改性得到了在水合润滑条件下低磨损的润滑水凝胶。Li 等[18]利用NaCl 提升了PVA 溶液的黏度，通过减少表面间的直接接触，进一步减少摩擦。本研究结果发现，通过在关节腔内注射仿生正常关节滑液流变学特征的水凝胶材料，有望减少关节磨损，延缓关节软骨的退变。

3.3 离子对发生骨关节炎时关节退变的抑制作用

生物活性离子在骨软骨组织的多个生理过程中扮演着重要角色，对于维持组织代谢稳态发挥重要作用。研究表明，镁离子能抑制软骨组织中MMP-13 和IL-6 的表达。此外，研究发现关节内注射氯化镁溶液可显著抑制大鼠骨关节炎模型中关节软骨的退变进展[19]。硅离子在骨软骨的发育过程中也起着至关重要的作用，口服硅离子有望减缓骨关节炎的发展[20]。本研究发现，离子不仅可以调控水凝胶材料的流变学特征，同时还有望通过提升凝胶渗透压增强水凝胶抑制细菌黏附的能力。此外，水凝胶作为一种离子控释载体，有望在未来负载不同的生物活性离子应用于治疗关节软骨的退变。

3.4 PWN 水凝胶与透明质酸的材料学性能比较及其临床意义

针对HA 类制剂在骨关节炎临床治疗中的不足之处，本研究以PVA、淀粉及NaCl为原料，合成一种新型可注射组织黏附性水凝胶PWN。在骨关节炎的病程进展过程中，关节滑液的黏弹性特征会发生变化，相比于正常成人的关节滑液，骨关节炎关节滑液的黏弹性特征显著降低[21]。因此，本研究通过对比PWN水凝胶与HA的流变学测试结果显示，相比于临床使用的HA产品，PWN具有与正常关节滑液相仿的黏弹性特征[21]，有望恢复病理环境下关节内滑液的流变学特征。

在骨关节炎进程中，关节滑液黏度逐渐降低以及剪切稀释行为的丧失，使得关节面的接触面积增大，从而加剧了关节面的磨损[22]。不同剪切速率下的黏度测试结果显示，水凝胶在低剪切速率下的高黏度能延长可注射生物材料在关节中的停留时间，而高剪切速率下的低黏度有利于临床注射和人体关节运动[23]。此外，PWN具有快速自愈合的能力，其自修复能力主要归因于PVA与淀粉之间氢键的解离与重塑作用[7]。这表明其在低剪切应力下可迅速恢复水凝胶的结构，维持水凝胶的功能。

PWN具有良好的细胞相容性和组织黏附性，有望黏附于软骨表面，保护关节软骨。此外，相比于HA，PWN 具有缓慢的降解速率，有望实现长期治疗，减少关节腔注射频率，更有益于对依从性差的患者使用[24]。

HA 和PW 无抑制细菌黏附的作用，而PWN 具有抑制细菌黏附的作用，推测关节内注射PWN可能会降低关节腔感染几率。PWN抑制细菌黏附的能力可能与其表面高渗环境抑制细菌生物膜的形成[25]，以及与水凝胶表面形成的水合润滑层有关[26]。上述机制减少了细菌与PWN表面的直接接触和细菌生物膜的形成，从而抑制细菌在PWN表面的黏附。

3.5 PWN水凝胶与透明质酸对大鼠膝关节力学失稳模型的疗效比较与可能机制

动物实验显示，诱导大鼠膝关节力学失稳治疗4 周后PWN 水凝胶能更有效地抑制骨关节炎关节退变。PWN 水凝胶未添加具有高生物活性的化学组分，因此PWN水凝胶对大鼠早期骨关节炎的治疗效果可能与PWN的物理特性有关。首先，PWN 具有与天然关节滑液相匹配的黏弹性特征，有望恢复骨关节炎关节滑液的流变学特性，减少关节面的磨损和组织内软骨细胞的应变，进而抑制关节软骨的退变。其次，PWN水凝胶的降解速率较慢且具有一定的组织黏附性，可以为骨关节炎关节表面提供长期稳定的保护作用。相较于HA，在关节腔内注射PWN水凝胶后，能黏附于软骨表面，更持久地改善关节腔的生物力学环境，从而延缓骨关节炎关节软骨的退变及软骨下骨的重构。因此，本研究开发的凝胶材料在未来有望作为关节腔内可注射制剂用于保护关节软骨，延缓骨关节炎的进展。

综上，本研究开发了一种流变学特征、组织黏附性、降解性能、抑制细菌黏附性能均优于临床使用的HA 产品且可抑制早期骨关节炎关节骨软骨退变的可注射水凝胶，其同时具有原材料来源广泛、成本低、制备简单的临床转化优势，未来有望单独或与HA 联合应用于骨关节炎的临床治疗。