miRNA-574-5p和HMGB1在急性呼吸窘迫综合征中的临床意义*

段松堂,卢 威,喻 巍,左姗姗

1.长江航运总医院重症监护室,湖北武汉 430040;2.河北医科大学第一医院重症二科,河北石家庄 050000

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以急性炎症肺损伤和低氧性呼吸衰竭为特征,随着肺部对局部炎症或全身炎症刺激产生的过度免疫反应而发展,影响全球大约10%的重症监护室成人患者,其住院病死率达到40%[1-2]。当前需要寻找新的生物标志物为预防和治疗ARDS提供潜在的治疗靶点。微小RNA(miRNA)是长度为18～24个核苷酸的小型非编码RNA,通过抑制目标mRNA翻译或通过靶向互补mRNA进行早期降解来调节基因表达[3]。miRNA被证明参与各种炎症疾病状态,可能在ARDS的病理生理过程中发挥作用,可能是有吸引力的靶向治疗候选物[4]。miR-574-5p被报道在多种疾病中发挥作用,如冠心病、肝细胞癌等[5-6]。高迁移率蛋白1(HMGB1)是典型的DNA结合核蛋白,介导感染和组织损伤中的炎症,在ARDS中大量释放[7]。据研究报道,HMGB1水平与重症肺炎并发ARDS、脓毒症合并ARDS等炎症疾病密切相关[8-9]。上述研究提示miR-574-5p、HMGB1可能在ARDS的病理过程中具有重要的作用。本研究检测了ARDS患者血清miR-574-5p、HMGB1水平,旨在探讨其在ARDS中的意义,为制订新的ARDS治疗策略提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2018年6月长江航运总医院收治的94例ARDS患者作为观察组,其中男53例、女41例,平均年龄(44.65±11.76)岁,平均体重指数(22.87±2.19)kg/m2,吸烟32例,急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)评分(21.62±7.15)分,依据相关标准将ARDS患者分为:轻症组38例,血氧分压(PaO2)/吸入气中的氧浓度分数(FiO2)在201～300 mmHg;中症组29例,PaO2/FiO2在101～<201 mmHg;重症组27例,PaO2/FPiO2<101 mmHg[10]。纳入标准:所有患者符合ARDS诊断标准[10]且均为第一次确诊,住院时间≥1周,年龄在18周岁以上,心肺功能正常,临床资料齐全,签署知情同意书。排除标准:合并严重感染性疾病、肿瘤或其他疾病的患者。另纳入同期于长江航运总医院体检的65例体检健康者作为对照组,其中男38例、女27例,平均年龄(43.24±12.60)岁,平均体重指数(23.06±2.05)kg/m2,吸烟14例。两组性别、年龄等比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有受试者均签署了知情同意书。本研究获得医院伦理委员机构的批准(批准号:20170425)。

1.2方法 收集观察组入院24 h内及对照组体检当天的空腹肘静脉血5 mL,在4℃条件下进行离心10 min,转速为3 000 r/min。收集上层血清,分装到离心管并转移至-80 ℃冰箱保存待测。

1.3观察指标 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清miR-574-5p。根据试剂盒的说明书,使用Trizol试剂(货号:10296028,购于赛默飞世尔科技有限公司)提取血清总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(购于北京凯乐博科技发展有限公司)检测总RNA浓度和纯度。检测合格的RNA样品,使用promega逆转录试剂盒(货号:A3500,购于上海联硕生物科技有限公司)将其逆转录为cDNA。将获得的cDNA按照TB Green®Premix Ex Taq Ⅱ Kit(货号:RR820A,购于日本TaKaRa公司)试剂盒说明书,在ABI7500荧光定量系统上通过qRT-PCR进行表达分析,反应条件为95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s 40个循环,60 ℃退火34 s。引物序列见表1,干粉由上海生工公司合成。以U6为内参基因,使用2-ΔΔCt方法计算miR-574-5p的相对表达水平。采用HMGB1 酶联免疫吸附试验试剂盒(货号:YM-QP11257,购于上海远慕生物科技有限公司)检测血清HMGB1水平,具体操作参照试剂盒说明书。

表1 引物序列

1.4随访 从患者入院第二天开始进行追踪随访,记入院28 d的生存状况。

2 结 果

2.1观察组和对照组血清miR-574-5p、HMGB1水平比较 与对照组比较,观察组血清miR-574-5p和HMGB1水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 观察组和对照组血清miR-574-5p、HMGB1水平比较

2.2不同病情严重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比较 不同病情严重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);中症组患者血清miR-574-5p、HMGB1水平高于轻症组,且重症组高于中症组(P<0.05)。见表3。

表3 不同病情严重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比较

2.3观察组血清miR-574-5p、HMGB1水平与APACHEⅡ评分的相关性分析 观察组血清miR-574-5p、HMGB1水平与APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.529,P<0.001;r=0.583,<0.001),见图1。

注:A为miR-574-5p与APACHEⅡ评分的相关性;B为HMGB1水平与APACHEⅡ评分的相关性。

2.4观察组血清miR-574-5p水平与HMGB1的相关性分析 观察组血清miR-574-5p水平与HMGB1呈正相关(r=0.422,P<0.001),见图2。

图2 血清miR-574-5p水平与HMGB1相关性的散点图

2.5不同预后患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ评分比较 根据28 d随访结果,可将ARDS患者划分为生存组(59例)和死亡组(35例),生存组患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ评分均低于死亡组(P<0.05),见表4。

表4 不同预后患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ评分比较

2.6多因素Cox回归分析ARDS患者生存的影响因素 多因素Cox回归分析结果显示,APACHEⅡ评分及血清miR-574-5p、HMGB1水平均为影响ARDS患者生存的独立危险因素(P<0.05),见表5。

表5 多因素Cox回归分析ARDS患者生存的影响因素

3 讨 论

在过去的50年里,临床工作者对ARDS的流行病学、病理生理学和发病机制有了更多的了解,从而制订了新的治疗策略,明显提高了ARDS患者的生存率。然而,重症ARDS的病死率仍居高不下,因此早期评估ARDS的危险分层和优化管理对于改善预后至关重要。

据报道,miRNA的表达失调严重影响了ARDS患者的病情发展和预后[11]。miR-574-5p位于人类4号染色体上,在多种疾病中发生变化。研究发现,miR-574-5p在宫颈癌患者的血清中高表达,作为促癌基因参与了肿瘤的发生发展[12]。杨晓伟等[5]报道,miR-574-5p在冠心病患者的血清和平滑肌细胞中表达上调,可能是潜在的诊断生物标志物。本研究结果显示,ARDS患者血清中miR-574-5p水平升高,与杨晓伟等[5]研究报道的结果类似,提示miR-574-5p的表达可能与ARDS的发生相关。进一步研究发现,miR-574-5p水平随着病情严重程度加重逐渐升高,并且与APACHEⅡ评分呈正相关,APACHEⅡ评分越高,则患者病情越重,是评估ARDS危重症患者预后的重要参照依据,说明miR-574-5p的表达可能与ARDS的严重程度有关。死亡组miR-574-5p水平明显高于生存组,结果表明,miR-574-5p可能与ARDS患者的预后有关。以上结果表明miR-574-5p有作为ARDS患者病情评估和预后预测的潜力。

血清HMGB1作为一种炎症介质,可加重炎症损伤从而诱发ARDS或致死性炎症反应[13]。既往报道表明,HMGB1水平升高与多种疾病相关,能反映炎症和组织损伤的严重程度,可作为生物标志物来预测疾病进展。郭小芙等[14]发现,脓毒症合并ARDS患者血清中HMGB1水平升高,是脓毒症患者并发ARDS的危险因素之一,能作为早期预测ARDS的参考指标。另一项研究也报道了血浆HMGB1水平升高与ARDS患者的病情严重程度和预后有关[15]。本研究与上述研究结果类似,HMGB1水平在ARDS患者血清中升高,且随着水平的升高,病情严重程度逐渐加重,死亡组患者HMGB1水平高于生存组,相关性分析结果表明,HMGB1水平与APACHEⅡ评分呈正相关,提示血清HMGB1水平有助于评估ARDS的病情发展和预后。

动物模型研究证实,miR-574-5p可以通过靶向HMGB1缓解ARDS,然而HMGB1的过表达能够逆转miR-574-5p的抗炎作用[16]。ARDS患者血清miR-574-5p水平与HMGB1呈正相关,分析其原因,miR-574-5p水平升高可能为机体的代偿性适应,但miR-574-5p对HMGB1的靶向抑制作用不及疾病诱发HMGB1表达的作用,进而导致二者水平均升高,但二者也可能存在靶向关系。miR-574-5p和HMGB1被认为是评估脓毒症患者预后的独立因素[17-18]。多因素Cox回归分析表明,APACHEⅡ评分及miR-574-5p、HMGB1水平均为影响ARDS患者生存的独立危险因素,提示血清miR-574-5p和HMGB1可能作为评估ARDS患者预后的分子标志物,且二者呈正相关,该结果可能为ARDS的治疗提供新的见解。

综上所述,ARDS患者血清miR-574-5p、HMGB1与ARDS的病情严重程度和预后密切相关,具有作为新的治疗靶点的潜力,对于临床优化治疗和改善预后具有重要的意义。但本研究仍有缺陷,如miR-574-5p是否可通过靶向HMGB1影响ARDS的病情进展仍不明确,需要在未来的研究中补充基础实验进行说明。