西瓜枯萎病生防菌的分离鉴定及其生防潜力研究

许配玲，韩文心，王 刚，陈 雯，高鸿姗，吕明慧，杨项明，朱彦泽，蒋春号

（南京农业大学植物保护学院，南京 210095）

随着西瓜种植面积的增加和连茬耕作，西瓜上的病害也在逐渐加重，其中西瓜枯萎病是最为严重的西瓜病害之一，在西瓜的整个生育期都可发病[1]。枯萎病通常是由尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum引起的一种土传性病害，也可称死秧病，或萎蔫病[2]，可造成西瓜产量下降，严重时甚至绝产，给西瓜生产带来巨大的经济损失和资源浪费[3]。目前，使用有益微生物和拮抗菌对西瓜枯萎病进行防治是一种高效兼环境友好型的生物防治方法，具有较大的应用潜力。

几丁质，俗称甲壳素，广泛存在于微生物、植物及动物个体中，是真菌、藻类的细胞壁及虾、蟹、昆虫等动物外壳的主要组成成分[4]。几丁质酶是一种能够将几丁质彻底降解为N-乙酰氨基葡萄糖单体或寡聚体的糖苷水解酶[5]，能够直接降解真菌细胞壁的主要组分之一—几丁质，使菌丝生长受阻。植物真菌病害一直是影响我国农业生产和食品安全的重要问题。化学杀菌剂的使用带来了严重的环境问题。因此，越来越多的人将目光投向了生物防治。大多数植物病原真菌的细胞壁中主要成分为几丁质，这就使几丁质酶活性菌成为了潜在的抗真菌生防菌株。

细菌是几丁质酶的重要来源，已被鉴别的几丁质酶产生菌主要包括气单胞菌属Aeromonas[6]、沙雷氏菌属Serratia[7]、肠杆菌属Enterobacter[8]、链霉菌属Streptomyces[9]、芽胞杆菌属Bacillus[10]和弧菌属Vibrio[11]等。已有研究表明几丁质酶活性菌对多种病原真菌都具有一定的抑制活性，能作为较好的生物防治剂，王巧贞等从茅尾海红树林桐花树根际土壤中筛选几丁质酶活性菌，获得3 株芽胞杆菌、1 株胞囊杆菌和1 株链霉菌，对芬芳镰刀菌Fusariumredolens、藤黑镰孢菌Fusariumfujikuroi、腐皮镰刀菌Fusariumsolani三种病原菌都具有一定的抑制活性[12]，其他细菌如沙雷氏菌属Serratia[13]和假单胞菌属Pseudomonas[14]等微生物产生的几丁质酶也被报道具有拮抗致病性真菌的作用。

红树林是指分布在沿海潮间带和入海河口以红树科植物为主体的常绿灌木或者乔木组成的潮滩湿地木本植物群落[15]。红树林地理位置和生态环境的特殊性造就微生物的复杂多样性，这些微生物可以产生新颖性的活性成分[16,17]，包括来源于几丁质降解菌的几丁质酶。

本研究从广东珠海红树林根际土中分离筛选到 1 株对西瓜枯萎病菌拮抗作用显著的放线菌PL-29 菌株，通过形态特征、生理生化测定和分子生物学鉴定，明确了菌株PL-29 的分类地位，并对该菌株的防治效果及其作用机制进行了初步研究，探究其作为生防菌的潜在价值，以期为其生防菌剂的开发及其对西瓜枯萎病菌的防治提供了理论依据，也为丰富红树林土壤来源的农业生防菌株资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤样品采集自广东省珠海市淇澳岛红树林木榄根际土、桐花树根际土、银叶树根际土、杨叶肖槿根际土、卤蕨根际土、海漆根际土，广东省珠海市横琴滨海土样，广东省珠海市三灶海滨土，广东省珠海市三灶红树林海麻根际土。

供试菌株：尖孢镰刀菌西瓜专化型Fusariumoxysporumf.sp.niveum、禾谷镰刀菌F.graminearum、辣椒疫霉Phytophthoracapsici、灰葡萄孢Botrytiscinerea、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani和瓜类蔓枯病菌Didymellabryoniae，均由南京农业大学生物农药及绿色植物保护实验室提供。

1.2 几丁质酶活性生防菌的分离纯化

对每份样品称取碎土3 g，装入50 mL无菌离心管中，加入27 mL无菌水，手动混匀后置于摇床以200 r/min的转速震荡0.5 h，取出后静置5 min，用无菌水稀释浓度梯度分别为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。将10-3～10-6三个浓度梯度的溶液取100 μL 均匀涂布在胶体几丁质为唯一碳源的培养基上，每个浓度梯度平板3 个重复，28 ℃下培养48 h 后，挑取不同形态特征的单菌落进行多次纯化，纯化后的单菌落细菌悬浮于80%的甘油中，置-80 ℃超低温冰箱中保存、备用。

1.3 几丁质酶活性测定

胶体状几丁质的制备：20 g 甲壳素溶于350 mL 浓盐酸，4 ℃放置24 h，玻璃棉过滤，滤液加入2 L冰无水乙醇（-20 ℃过夜），10000 r/min 离心20 min，沉淀用自来水冲洗，直至pH 值为中性，冷冻干燥，-20 ℃密封保存。使用时，胶体状几丁质必须用手动匀浆器至少研磨5 次。

胶体状几丁质为唯一碳源的培养基（Chi-Ayers）：（NH4H2PO41.0 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，胶体状几丁质1%（w/v），定容至1000 mL，pH 值=7.0，琼脂20 g），在培养基平板上放入灭过菌的滤纸片，两侧滤纸片点悬浮好的菌液，另外两侧点无菌水作为对照，重复3 次，28 ℃培养5 d 后观察有无透明圈，测量透明圈的内径和外径[18]。

1.4 几丁质酶活性生防菌的筛选

采用平板对峙培养法，以西瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌西瓜专化型为靶标菌，对上述筛选得到的具有几丁质酶活性的菌株进行复筛。用5 mm 打孔器取靶标菌菌饼接种到WA 培养基中央，用枪头挑取细菌单菌落在距病原菌菌饼约2 cm 处划两条平行线，以无菌水为对照，重复3 次，于25 ℃培养箱中倒置培养，观察并记录试验结果。同时利用实验室保存的禾谷镰刀菌、辣椒疫霉、灰葡萄孢、立枯丝核菌、瓜类蔓枯病菌5 种病原菌对菌株进行广谱抑菌能力的测定。

1.5 几丁质酶活性菌株的鉴定

生理生化鉴定：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行生理生化测定。测定的生理生化特性包括：碳源利用试验、M.R.试验、V.P.试验、硫化氢生成、硝酸盐还原、明胶液化、过氧化氢酶、淀粉酶试验[19]，每组试验3 个重复。

分子鉴定：利用16S rDNA 通用扩增引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）进行菌落PCR。PCR 反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环，最后72 ℃延伸5 min。将获得的PCR 产物送至南京擎科生物科技有限公司进行测序，将测得序列在NCBI 数据库进行BLAST 比对分析，并从GenBank数据库获得同源性高的相关菌株的基因序列，利用MEGA 11 软件进行序列多重比对，采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育进化树，最终确定菌株的分类地位。

1.6 10 株菌株对西瓜枯萎病的室内盆栽防效测定

选择健康饱满的西瓜种子催芽，将出芽一致的西瓜种子播种于装有无菌土壤盆砵中，待西瓜长出两片真叶时进行处理，采用灌根法，将悬浮好的1×108CFU/mL 的菌液缓慢灌入西瓜根茎周围，每盆接种20 mL，其中以清水作为对照，接种菌液后1～2 d 尽量不浇水,5 d 后浇灌1×107CFU/mL 的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，每株20 mL。试验重复3 次，30 d 后调查统计发病情况，并计算枯萎病病情指数和防治效果。参照徐敬华等[20]方法对病情分级，0 级：无病状；1 级：叶片或茎部萎蔫面积占全株的1/4 或不到1/4；2 级：叶片或茎部萎蔫面积占全株的1/2；3 级：叶片或茎部萎蔫面积占全株的3/4；4 级：整株萎蔫死亡。病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

1.7 10 株菌株对西瓜的促生作用测定

等到西瓜长出两片真叶时进行浇灌处理，将悬浮好的1×108CFU/mL 菌液缓慢灌入西瓜根茎周围，每株20 mL，其中以清水作为对照。接种菌液后1～2 d 尽量不浇水，此后常规浇水15 d 后重复浇灌处理一次。试验重复3 次，生防菌处理30 d 后，统计各处理植株的株高、茎粗、叶片数和叶绿素含量，小心剔除根部土壤，清洗干净后，自然风干，测定植株鲜重，60 ℃烘干48 h 后测植株干重。

1.8 菌株PL-29 对病原菌菌丝形态的影响

采用平板对峙法，将菌株PL-29 发酵液与尖孢镰刀菌共培养于PDA 培养基上，在培养基距中央二分之一处插入灭菌的载玻片，待菌丝长至载玻片上时，显微镜下观察菌丝形态[21]，重复3 次。

1.9 菌株PL-29 对病原菌孢子萌发的影响

取40 μL 过夜培养的菌株PL-29 发酵液10 倍稀释液于灭菌凹玻片中，以加入清水作为对照，随后加入40 μL 尖孢镰刀菌孢子悬浮液，混匀。25 ℃恒温培养，当对照处理的孢子萌发率达到90%左右时，调查孢子萌发情况，计算孢子萌发抑制率，抑制率（%）＝（对照组孢子萌发数－发酵液处理组孢子萌发数）/对照组孢子萌发数×100，调查孢子总数为200 个，重复3 次[22]。

1.10 菌株PL-29 对病原菌细胞膜完整性的影响

绿豆培养基中按1∶100 比例加入菌株PL-29 发酵液和菌丝悬液，在25 ℃下孵育12 h。收集菌丝于2 mL离心管内，弃上清，沉淀用1 mL PBS 重悬，加入5 μL PI 染色液。冰浴或4 ℃孵育20～30 min。检测前离心沉淀，用PBS 洗涤一次，重悬，制成玻片于荧光显微镜下观察荧光情况[23]，重复3 次。

1.11 菌株PL-29 对病原菌菌丝内ROS 积累的影响

绿豆培养基中按1∶100 比例加入菌株PL-29 发酵液和菌丝悬液，在25 ℃下孵育12 h。收集菌丝于2 mL离心管内，弃上清，沉淀用1 mL PBS 重悬，加入1 μL DCFH-DA，37 ℃细胞培养箱内避光孵育30 min。每隔3～5 min 颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触，检测前离心沉淀，用PBS 洗涤两次，重悬，制成玻片于荧光显微镜下观察荧光情况[24]，重复3 次。

1.12 数据统计与分析

采用Excel 2016 对试验数据进行处理，计算病情指数和相对防效，利用DPS 对数据进行单因素分析，采用Duncan 新复极差检验法进行多重比较（P＜0.05）检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 几丁质酶活性生防菌的分离纯化

从广东省珠海市淇澳岛红树林根际土土壤中共分离得到1000 余株菌株，通过测定几丁质酶活后筛选得到32 株菌株（图1），其中菌株PL-29 透明圈半径为2.30 mm，菌株PL-70 几丁质酶活性最高，透明圈半径达8.10 mm（表1）。

表1 几丁质酶活性测定结果Table 1 The Determination of chitinase activity

图1 几丁质酶活性测定Fig.1 Determination of chitinase activity

2.2 几丁质酶活性生防菌的筛选

平板拮抗试验结果表明，菌株PL-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80 和PL-86 都对西瓜枯萎病菌有较好的拮抗作用，其中菌株PL-29 对西瓜枯萎病菌的拮抗能力最强，抑菌带宽度为11.3 mm，除了对西瓜枯萎病菌具有良好的拮抗活性外，对供试的5 种其他植物病原真菌也有不同程度的拮抗活性。与菌株PL-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80 和PL-86 相比，几丁质酶活效果较好的菌株PL-34、PL-65、PL-66 和PL-70拮抗效果不明显（图2）。

图2 几丁质酶活性菌株对病原真菌平板拮抗Fig.2 Plate antagonism of chitinase active strains against pathogenic fungi

2.3 几丁质酶活性菌株的鉴定

生理生化特性：菌株PL-29 能利用葡萄糖、乳糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、阿拉伯糖、L-酪氨酸，不能利用D-核糖、甘氨酸、蔗糖（表2）；能使硝酸盐还原，明胶液化，生成H2S，不能使淀粉水解，VP 试验和接触酶试验阳性，MR 试验阴性（表3）。

表2 几丁质酶活性菌株碳氮源利用特征Table 2 Carbon and nitrogen source utilization characteristics of chitinase active strains

表3 几丁质酶活性菌株生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of chitinase active strains

分子鉴定：菌株PL-29 的16S rDNA 基因片段测序后得到全长为1356 bp 的序列（GenBank 登录号：OR574255），将测得序列在NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST 比对分析，发现与PL-29 同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取并下载同源性高的模式菌株或代表菌株的16S rDNA 序列作为参比对象，利用MEGA11 软件的邻接法（Neighbor Joining）构建系统发育树（图3）。结果表明，菌株PL-29 的16S rDNA 序列与黄三素链霉菌Streptomycesflavotricini聚在同一个分支，由此，将菌株PL-29鉴定为黄三素链霉菌。

图3 基于 16S rDNA 基因序列构建的菌株PL-29 的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree of strain PL-29 based on the sequence of 16S rDNA

结合生理生化特性和16S rDNA 基因序列分析，最终将菌株PL-28、PL-53、PL-80、PL-86 鉴定为S.flavotricini，菌株PL-25 鉴定为S.andamanensis，菌株PL-34 鉴定为Stenotrophomonasmaltophilia，菌株PL-65鉴定为S.tanashiensis，菌株PL-66 鉴定为Microbacteriumradiodurans，菌株PL-70 鉴定为Isoptericola jiangsuensis。

2.4 10 株菌株对西瓜枯萎病的室内盆栽防效测定

盆栽试验结果表明，相对于对照组，这10 株菌株都有不同程度的防病效果（图4）。由表4 可知，对照组病情指数高达84.03，菌株PL-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80、PL-86 处理的西瓜病情指数分别为38.19%、40.28%、30.91%、42.36%、37.85%、39.24%，均显著低于对照组，且对西瓜枯萎病的防治效果分别为54.49%、51.99%、63.11%、49.49%、54.88%、53.23%，其中菌株PL-29 处理组的病情指数最低，防治效果最好（表4）。

表4 10 株菌株对西瓜枯萎病的盆栽防治效果Table 4 The Effect of 10 strains on F.oxysporum f.sp.niveum in greenhouses

图4 10 株菌株对西瓜枯萎病的盆栽防治效果Fig.4 The Effect of 10 strains on F.oxysporum f.sp.niveum in greenhouses

2.5 10 株菌株对西瓜的促生作用测定

盆栽促生试验结果表明，与对照组相比，菌株PL-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80、PL-86 对西瓜植株都有一定的促生作用，株高、茎粗、叶片数、鲜重、干重和叶绿素含量较常规对照组均有不同程度的提高（图5）。由表5 可知，与对照相比，菌株PL-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80、PL-86 处理的西瓜株高分别增长16.74%、19.23%、25.79%、14.03%、23.76%、26.92%，茎粗分别增长4.88%、2.44%、9.76%、4.88%、9.76%、12.20%，鲜重分别增长26.67%、37.98%、58.79%、52.53%、52.32%、62.02%，干重分别增长33.80%、38.03%、45.07%、32.39%、35.21%、52.11%。上述结果表明，菌株PL-29 对西瓜植株具有较好的促生效果（表5）。

表5 10 株菌株对西瓜的促生作用效果Table 5 The Growth promotion effect of 10 strains on watermelon

图5 10 株菌株对西瓜的促生作用效果Fig.5 The Growth promotion effect of 10 strains on watermelon

2.6 菌株PL-29 对病原菌菌丝形态的影响

试验结果表明菌株PL-29 和尖孢镰刀菌共培养5 d 后，与对照组相比，处理组菌丝在形态上没有明显变化，但是分生孢子的数量明显减少（图6）。菌株PL-29 与尖孢镰刀菌共培养时，虽能明显抑制菌丝的伸长，但对菌丝形态没有明显影响。

2.7 菌株PL-29 对病原菌孢子萌发的影响

结果显示对照处理8 h 后，几乎所有的尖孢镰刀菌孢子均正常萌发，形成细长芽管，萌发率为90.33%。菌株PL-29 处理组的孢子萌发率为45.17%，抑制率为49.98%（表6），表明菌株PL-29 能够抑制尖孢镰刀菌孢子萌发，从而抑制病原菌的生长。

表6 菌株PL-29 对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制作用Table 6 The Inhibition efficacy of strain PL-29 on spore germination of F.oxysporum f.sp.niveum

2.8 菌株PL-29 对病原菌细胞膜完整性的影响

用碘化丙啶（PI）进行荧光染色，以检查尖孢镰刀菌膜完整性。碘化丙啶（PI）是一种不渗透膜的红色荧光染料，对于具有完整细胞膜的正常细胞不能染色，而膜受损的细胞可以通过碘化丙啶（PI）进行荧光染色，显示红色荧光。结果显示对照组未检测到明显的荧光（图7A），菌株PL-29 发酵液处理12 h 的尖孢镰刀菌菌丝能发出明显的红色荧光（图7B）。表明菌株PL-29 能破坏尖孢镰刀菌细胞膜的完整性，引起菌丝细胞的凋亡。

图7 菌株PL-29 对尖孢镰刀菌菌丝细胞膜完整性的影响Fig.7 The Effect of Strain PL-29 on membrane integrity of mycelia of F.oxysporum f.sp.niveum

2.9 菌株PL-29 对病原菌菌丝内ROS 积累的影响

利用DCFH-DA 检测菌丝中ROS 的产生，DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH 不会通透细胞膜，细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH 生成有绿色荧光的DCF。结果显示对照组只能发出微弱的绿色荧光(图8A)，菌株PL-29 发酵液处理12 h 的尖孢镰刀菌菌丝能发出明显的绿色荧光(图8B)，表明菌株PL-29 的处理可直接或间接导致尖孢镰刀菌菌丝中ROS 的积累。

图8 菌株PL-29 对尖孢镰刀菌菌丝内ROS 积累的影响Fig.8 The Effect of strain PL-29 on ROS accumulation in mycelium of F.oxysporum f.sp.niveum

3 讨论

几丁质是真菌细胞壁的主要成分之一，很容易受到各种几丁质水解酶的影响。因此，几丁质酶的产生在农业中可作为一种有效的生物防治剂用于对抗许多植物病原真菌。产生几丁质酶的微生物能够通过分解几丁质抑制真菌病原体菌丝的生长，进而降解细胞壁，破坏原生质膜[24]，几丁质酶活性菌由于其功能多样性，在生物防治中也发挥着越来越重要的作用，也具有重要的研究价值。

西瓜枯萎病是一种由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌西瓜专化型F.oxysporumf.sp.niveum寄生引起的真菌性土传病害[26]。目前针对西瓜枯萎病的防治方法主要有农业防治、化学防治和生物防治等。生物防治因其使用有益微生物和拮抗菌对西瓜枯萎病进行防治是一种高效兼环境友好型的防治方法，目前已成为新的研究热点，本研究从广东省红树林土壤中分离得到6 株拮抗效果好的链霉菌菌株，对禾谷镰刀菌菌F.graminearum、辣椒疫霉P.capsici、灰葡萄孢B.cinerea等多种病原菌都具有一定的拮抗能力，其中菌株PL-29 能显著促进西瓜的生长提高对西瓜枯萎病的抗性，结合生理生化特性和16S rDNA 基因序列分析，最终将拮抗菌PL-29 鉴定为黄三素链霉菌S.flavotricini。对链霉菌的相关研究也表明链霉菌具有潜在的应用价值，孙于淼等[27]研究发现链霉菌5406 不仅对西瓜幼苗有明显的促生作用，同时对西瓜枯萎病也有较好的抑制效果。张雨阳等[28]研究表明黄三素链霉菌发酵液具有广谱抑菌活性，对芒果炭疽病病原菌等12种植物病原菌均有抑制效果。

在过去的几十年里，放线菌一直是在医疗和农业应用中次生代谢产物和酶的生产中最广泛利用的微生物群。放线菌特别是链霉菌是新型抗生素、酶、酶抑制剂、免疫调节剂和维生素的良好来源。红树林作为特殊的生态系统，具有盐渍化、有机质含量高、氧气缺乏等特征，导致红树林生境中的放线菌形成了丰富的微生物类群和独特的代谢途径，代谢产物丰富[29]。研究发现红树林放线菌所产生的抗菌活性代谢产物包括大环内脂类[30]、生物碱[31,32]、萜类[33]、酚类[34]、肽类[35]等。链霉菌产生的活性抑菌物质在抵御病原菌方面也发挥着独特的作用，研究表明链霉菌能通过分泌活性物质雷帕霉素来抑制赤霉病菌菌丝生长，降低病菌致病力和真菌毒素的合成，干扰病菌的自噬平衡来控制病害[36]。本研究从红树林土壤中筛选得到的链霉菌PL-29 其发酵上清液对病原菌也具有较好的抑制效果，具有较大生防潜力，其抗菌活性代谢产物及其防病机制还有待进一步研究。

对菌株PL-29 的作用机制进一步研究表明，菌株PL-29 能抑制尖孢镰刀菌孢子的产生及萌发，从而抑制病原菌的生长。此外，它还可以破坏质膜完整性，诱导ROS 积累。Lin 等[37]的研究也表明链霉菌能导致病原菌膜完整性的丧失和活性氧（ROS）的积累。过量的ROS 积累会导致脂质氧化损伤，诱导细胞衰老死亡[23]，质膜对于维持细胞形态和功能至关重要，链霉菌产生的纳他霉素能破坏灰霉和扩张青霉的质膜，导致细胞内内容物释放，最终导致细胞死亡[39,40]，链霉菌产生的雷帕霉素能通过调节灰霉菌的自噬活性和膜通透性来控制灰霉菌[23]。

综上所述，菌株PL-29 可作为防治植物真菌病害的生防菌株且具有潜在的重要价值，对该菌株的分离鉴定和作用机制初步研究也为链霉菌后续的深入研究及其生防菌剂的开发及其对西瓜枯萎病菌的防治提供了理论依据，也为丰富红树林土壤来源的农业生防菌资源提供参考。另外对于菌株PL-29 中次生代谢产物分离与活性测定、作用机制以及菌剂的开发等还有待进一步研究。