无致病力青枯菌FJAT-aRS01的固态发酵及对茄果类蔬菜青枯病的防治效果

郑雪芳，王阶平，陈燕萍，车建美，陈 峥，陈梅春，刘 波

（福建省农业科学院资源环境与土壤肥料研究所, 福州 350003）

由青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum（简称青枯菌）引起的作物青枯病是一种毁灭性土传病害，其在茄果类蔬菜上尤为严重[1]。常用防治策略包括抗病品种、嫁接、轮作、化学农药与土壤改良等，但效果均不稳定[2]。目前为止，具有抗青枯病性能的作物品种很少，而且抗性不稳定[3]；利用嫁接方法防治番茄青枯病虽获得成功，但因成本太高，技术难度大而导致推广和普及困难[4,5]；轮作在一定程度上能够较好地防治青枯病，但受地理环境的影响，也难以大面积推广[6]；化学农药防治虽有一定的防效，但随着化学农药使用量的日益增大，易产生抗药性、农药残留，小种分化型复杂，而且尚未有一种理想的农药可以防治青枯病[7]，这些因素限制了他们在实际生产中的应用；土壤改良能有效改善土壤理化状况和生物特性，增强植物抗病能力，但其存在见效慢、成本高等问题[8]。生物防治具有无污染、有利于人畜安全、对生态环境友好、不易产生抗性等优点，使得人们将目光逐渐转向青枯病的生物防治[9,10]。

利用无致病力青枯菌研发植物疫苗来防治作物青枯病具有重要的生防应用潜力[11]。无致病力青枯菌可在导管及相邻组织内广泛分布，利用生态位点竞争和营养竞争阻止或延迟强致病力的菌株侵入，或者激发植物免疫系统产生抗病反应，从而防止或延迟植株发病[12]。研究人员通过自然分离筛选、转座子Tn5插入、基因工程等途径获得青枯菌的无致病力突变菌株，用于防治青枯病，均取得良好的防治效果[13-15]。作者在前期的研究中，将一株无致病力青枯菌FJAT-1957 进行细菌色谱纯化，获得高纯度和防效的菌株FJAT-aRS01（专利号ZL 2015 1 0589990.1）。研究发现该菌株对番茄盆栽苗和田间小区的防效，分别达100%和85.71%；如果利用该菌株研发的植物疫苗应用到茄果类蔬菜（番茄、茄子和辣椒）种苗健康繁育上，将极大地提升种苗的抗病能力。

在生防制剂的规模化生产中，为保障生产的可持续，选择来源广、营养丰富、价格低的发酵原料是降低生产成本的关键[16]。巨菌草是一种多年生禾本科植物，分蘖能力、适应性强、是目前已知的禾本科中产量最高的植物，每亩平均年产量高达20～30 t，是一种可持续开发的资源[17]。巨菌草糖分和粗蛋白含量高，富含赖氨酸、氨基酸、类黄酮、皂苷、芳香类物质、表面活性剂及各类有机盐[18]，且具有来源广、数量大和价格低的特点，是一种优质的生防菌固态发酵原料。

本研究以巨菌草渣作为无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵的主要原料，初步筛选适宜FJAT-aRS01发酵的培养基，进一步运用正交试验对FJAT-aRS01 固态发酵培养基配方和培养条件进行优化。同时，研究FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜种子萌发、植株生长及青枯病害的防治效果，以期为无致病力青枯菌FJAT-aRS01 的工业化生产与田间应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

菌株FJAT-aRS01 是将无致病力青枯菌FJAT-1957 进行细菌色谱纯化，获得高纯度和防效的无致病力青枯菌，强致病力青枯菌FJAT91 分离自番茄青枯病株的根际土壤，对番茄、辣椒和茄子均具有强致病力，供试菌株均由福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库收集保存。巨菌草渣由福建华闽菌草产业发展有限公司提供，番茄（金石王1 号）、辣椒（B222）和茄子（如意情）种苗均购自厦门如意集团有限公司。优化培养基原料：玉米粉、麸皮、稻壳、米糠、豆粕均购自农贸市场。蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、牛肉浸膏、酪水解素、酵母粉、琼脂粉、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）均为国药化学纯试剂。聚丙烯灭菌袋（14 cm×28 cm×5 cm）购自武汉宜康菌业科技有限公司。

1.2 培养基配制

营养肉汤培养基（Nutrient Broth，NB）：蛋白胨5 g，蔗糖10 g，牛肉浸膏3 g，酵母粉1 g，蒸馏水定容至1 L，pH 为7.2，121℃灭菌20 min；TTC 培养基参照Kelman[19]方法配置，将蛋白胨10 g、水解酪蛋白1 g、葡萄糖5 g 和琼脂17 g 用蒸馏水定容至1 L，pH 为7.2，121℃灭菌20 min，冷却至50 ℃～60 ℃，加入1.0% TTC 溶液至终浓度为0.5 g/L。

1.3 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵方法

1.3.1 种子液制备 菌株FJAT-aRS01 活化于TTC 培养基，30 ℃培养2 d，挑取单菌落于NB 培养基中，于30 ℃、170 r/min 摇床振荡培养24 h，即为无致病力青枯菌FJAT-aRS01 的种子液（2×109CFU/mL）。

1.3.2 固态发酵基础培养基筛选 将玉米粉、麸皮、豆粕、米糠等原料分别与巨菌草渣+稻壳（90%巨菌草渣+10%稻壳）按4∶6（质量比）混合，按料水比1∶0.8（质量比）加水并拌匀，调节pH 7.0～7.5，装入聚丙烯灭菌袋（14 cm×28 cm×5 cm），121 ℃灭菌20 min，温度降至常温后，按质量比为15%的接种量接入种子液体，30 ℃培养2 d。称取10 g 固态发酵物溶于90 mL 无菌水，10 倍梯度稀释后，涂布于TTC 培养基，30 ℃培养48 h，统计不同培养基组合固态发酵物中活菌的数量。

1.3.3 固态发酵培养基正交优化 根据筛选的主基质结果，以巨菌草渣、玉米粉、米糠、稻壳为影响因子，采用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验，正交优化培养基灭菌、接种及发酵方法与上述相同，统计不同正交优化组合固态发酵物中FJAT-aRS01 活菌数的方法与上述相同。

1.3.4 固态发酵条件正交优化 针对接种量、水料质量比、发酵时间和装袋量四个影响因素，以发酵料中无致病力青枯菌FJAT-aRS01 活菌数为考察指标，采用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验进行FJAT-aRS01 固态发酵条件优化，正交优化培养基灭菌、接种及发酵方法与上述相同，统计不同正交优化组合固态发酵物中FJAT-aRS01 活菌数方法与上述相同。

1.4 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物的质量检测

1.4.1 感观指标检测 检测FJAT-aRS01 固态发酵物的颜色、质地（松散度、有无结块等）和气味。

1.4.2 菌体数检测 随机选取3 袋固态发酵物，称取10 g，溶于90 mL 无菌水，10 倍梯度稀释后，涂布于TTC 培养基，30 ℃培养48 h，统计无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵产物的活菌数量。

1.4.3 理化性质和营养成分测定 随机选取3 份无致病力青枯菌固态发酵产物，送至检测资质单位测定理化性质和营养成分，包括水分（按GB/T 8576-2010 标准进行）、pH（按NY/T 1121.2-2006 标准进行）、有机质（按NY/T 1121.2-2006标准进行）、全氮（按NY/T 1121.24-2012标准进行）、粗纤维（按GB/T 6434-2006标准进行）等，统计平均值。

1.4.4 FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜种子萌发的影响 以番茄（金石王1 号）、辣椒（B222）和茄子（如意情）的种子为试验材料，称取100 g 无致病力青枯菌固态发酵物，用150 mL 无菌水慢慢浇灌至饱和，静置24 h 后，用4 层纱布包裹，挤压过滤，收集滤液，获得浸提液（含菌量1.20×109CFU/mL）。用无菌水将浸提液分别稀释至5、10、20、50、80、100 倍，4 ℃保存备用。采用纸上萌发法，番茄、辣椒和茄子种子于55 ℃温水漂洗2 次，捞出沥干，用上述不同稀释倍数的浸提液浸种8 h，无菌水浸种为对照（CK）。浸种后转移至底部铺置两层滤纸的9 cm 的透明培养皿中，每培养皿15 粒种子，3 次重复，7个处理。将培养皿置于27 ℃恒温人工气候箱，光照16 h、黑暗8 h，跟踪观察种子萌发情况，记录发芽数，直至连续3 d 无新的发芽粒出现，测定种子发芽率、发芽指数、种子活力指数。发芽率（%）=（指定天数的发芽种子数/供试种子数）×100；发芽指数（GI）=Σ（Gt/Dt），Gt 为第t 天的种子发芽数，Dt 为相应发芽天数；活力指数（VI）=发芽指数×胚根长（cm）。

1.4.5 FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜青枯病的防治效果 强致病力青枯菌FJAT-91 在TTC 平板上活化后，转接至NB 培养基中，于170 r/min、30 ℃培养24 h，菌液稀释至108CFU/mL。按不同质量比（添加量0、5%、10%、15%、20%、25%），将无致病力青枯菌固态发酵物（含菌量1.80×109CFU/g）添加至江平蔬菜育苗基质（购自厦门市江平生物基质技术股份有限公司）中，充分混匀后，装置盆钵中（小钵直径15 cm、高10 cm），分别将苗龄20 d 的番茄（金石王1 号）、辣椒（B222）和茄子（如意情）移栽至盆钵，500 g/钵。移栽3 d 后，灌根接种FJAT-91 的菌液（接种浓度1×108CFU/mL），接种量为100 mL/盆，每处理15 盆，3 次重复。接种后每天观察植株的发病情况，统计青枯病发病率和防治效果。发病率（%）=（发病株数/总株数）×100，防效（%）=（处理组发病率－对照组发病率）/对照发病率×100。

1.4.6 FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜植株生长的影响 栽培基质中添加不同量无致病力青枯菌固态发酵物（添加量0、5%、10%、15%、20%、25%），充分混匀后，装置盆钵中（15 cm×10 cm），500 g/钵，分别将苗龄20 d 长势一致的番茄（金石王1 号）、辣椒（B222）和茄子（如意情）种苗，移栽至盆钵中，4 株/盆，每种添加量处理6 盆（24 株）。盆栽苗移至人工气候室培养，温度为30±1 ℃，相对湿度90%。培养20 d 后随机选取15 株测量植株的株高（卷尺测量叶片所能到达最高高度）和茎粗（游标卡尺测量离基质土面1 cm 茎部）。

1.5 数据统计与分析

采用DPS 7.0 软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵基础培养基的筛选

结果如表1 所示，巨菌草渣+稻壳+玉米粉处理组FJAT-aRS01 的活菌数最大为3.67×108CFU/g；其次是巨菌草渣+稻壳+米糠，该处理组FJAT-aRS01 的活菌量为2.60×108CFU/g；巨菌草渣+稻壳+豆粕和巨菌草渣+稻壳+麸皮处理组FJAT-aRS01 的活菌数分别为1.29×107和2.17×107CFU/g。

表1 FJAT-aRS01 固态发酵基础培养基筛选Table 1 Selection of basic medium for solid-state fermentation of the strain FJAT-aRS01

2.2 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵培养基优化

固态发酵培养基正交试验结果表明，处理水平2：巨菌草渣40 g、玉米粉30 g、米糠30 g、稻壳10 g，所培养出来的活菌数最多，为1.01×109CFU/g，与其他各处理水平差异达极显著水平（P＜0.01）；其次是处理水平1：巨菌草渣40 g、玉米粉15 g、米糠15 g 和稻壳5 g 所培养出来的FJAT-aRS01 活菌数为1.37×108CFU/g；处理水平5 的FJAT-aRS01 活菌数最低，为1.70×107CFU/g（表2）。因此，FJAT-aRS01固态发酵最优培养基配方为巨菌草渣40 g、玉米粉30 g、米糠30 g 和稻壳10 g。

表2 固体发酵培养基优化正交试验结果Table 2 The results of different treatments in orthogonal experimental design of solid-state fermentation medium

2.3 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵条件优化

固态发酵条件正交试验结果表明，处理水平9：接种量15%、水料质量比为0.8:1、装袋量150 g 和发酵时间2 d，FJAT-aRS01 活菌数最大，为3.31×109CFU/g，与其他各处理水平的差异达极显著水平（P＜0.01）；其次是处理水平5 和7，这2 种发酵条件下，FJAT-aRS01 活菌数分别为5.74×108和5.04×108CFU/g；处理水平6，FJAT-aRS01 活菌数最低，为2.99×106CFU/g（表3）。因此，FJAT-aRS01 固态发酵的最优发酵条件为接种量15%、水料质量比为0.8、装袋量150 g 和发酵时间2 d。

2.4 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物的感观指标和菌体数

无致病力青枯菌固态发酵物为黄褐色，质地松散，无结块（图1），带有发酵气味。随机抽取3 袋FJAT-aRS01 固态发酵物样本的活菌量分别为2.02×109CFU/g（图2A）、1.52×109CFU/g（图2B）和1.67×109CFU/g（图2C）。

图1 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 的固态发酵物Fig.1 Agents of R.solanacearium avirulent strain FJAT-aRS01

图2 随机抽取3 袋FJAT-aRS01 固态发酵物在TTC 平板上分离菌的形态特征Fig.2 Colony morphology of isolates from FJAT-aRS01 agents by three random samples

2.5 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物的营养成分分析

无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物的营养成分测定结果见表4，水分平均含量为17.8%，pH 平均值为5.8，有机质平均含量为27%，全氮平均含量为0.54%，全磷平均含量为130.33%，全钾平均含量为0.57%，粗纤维平均含量为13.15%，其营养成分含量超过微生物肥料的国家标准（NY/T 798-2015），即总养分（N+P2O5+K2O）为8.0～25.0，有机质≥20.0%。

表4 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物的营养成分分析Table 4 Nutrient components analysis of FJAT-aRS01agents

2.6 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜种子萌发的影响

种子萌发试验结果表明，无致病力青枯菌固态发酵产物浸提液的50、80 和100 倍稀释液处理的番茄种子发芽率分别为79.33%、81.00%和76.17%，均显著高于对照（72.67%）（P＜0.05），50 倍稀释液处理的番茄种子发芽指数（18.26）和活力指数（133.69）也显著高于对照（发芽指数12.54，种子活力指数109.65）。无致病力青枯菌固态发酵产物浸提液的80 倍和100 倍稀释液处理的辣椒种子发芽率分别为88.80%和93.30%，均显著高于对照（82.93%），其100 倍稀释液处理的辣椒种子发芽指数（60.28）和种子活力指数（420.67）也显著高于CK（发芽指数56.59，种子活力指数254.64）。无致病力青枯菌固态发酵产物浸提液的100 倍稀释液处理茄子的种子发芽率（97.78%）、发芽指数（14.10）和种子活力指数（59.93）均显著高于对照的发芽率（91.11%）、发芽指数（11.45）和种子活力指数（36.88）。无致病力青枯菌固态发酵产物浸提液的稀释数低于50 倍会抑制番茄、辣椒和茄子种子萌发，其发芽率、发芽指数和种子活力指数均显著低于无菌水对照（P＜0.05，表5）。

表5 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜种子萌发的影响Table 5 Effects of FJAT-aRS01 agents on germination of solanaceous vegetable seeds

2.7 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜青枯病的防治效果

青枯病防效试验结果表明，在观察期30 d 内，番茄、辣椒和茄子对照组（添加量为0）分别在接种强致病力青枯菌FJAT-91 后6、8 和12 d 植株开始发病，接种30 d，番茄、辣椒和茄子发病率分别为99.33%、100%和99%。番茄、辣椒和茄子试验组中，均是FJAT-aRS01 固态发酵物添加量25%处理组的青枯病发病率最低，防效最好；该添加量处理对番茄、辣椒和茄子的青枯病防效分别达85.33%、75.67%和80.11%（表6）。

表6 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜青枯病的防治效果Table 6 Control effects of FJAT-aRS01 agents against bacterial wilt of solanaceous vegetables

2.8 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜植株生长的影响

无致病力青枯菌固态发酵物添加量小等于15%，会促进番茄、辣椒和茄子植株生长，反之则抑制植株生长。对于番茄，添加量为5%时促长效果最好，其株高和茎粗分别比对照增加29.62%和25.77%。对于辣椒和茄子，添加量10%促长效果最好，辣椒的株高和茎粗分别比对照增加55.15%和33.66%，茄子的株高和茎粗分别比对照增加20.89%和13.01%（表7）。

表7 无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜植株生长的影响Table 7 Effect of FJAT-aRS01 agents on plant growth of solanaceous vegetables

3 讨论

生防菌的生产与应用，发酵技术是关键[20]。目前市场上生防菌制备的方法多采用液体深层发酵技术，其对设备要求高，生产工艺复杂，而固体发酵具有培养基来源广且价格低、能耗少、技术较简单、产物产率较高、环境污染较小等优点，在微生物生产应用中愈加广泛[21]。陈新元等[21]利用农产品下脚料（玉米芯等）对生防芽胞杆菌BMF04 进行固态发酵，有效降低生产成本，提高生产效率。本研究将农业副产物巨菌草渣进行资源化利用，用作无致病力青枯菌FJAT-aRS01 固态发酵培养基成份，在降低生产成本的同时，解决了农业副产品废弃物对环境造成的污染，实现农业可持续发展。

无致病力青枯菌FJAT-aRS01 对茄果类蔬菜青枯病的防效好，具备开发植物疫苗的潜能。植物疫苗的开发利用应当考虑剂型的适宜性、运输便利性、生产成本等[21]。目前青枯病生防菌的发酵和生产工艺研究有较多报道[20,23,24]。陈燕萍等[20]利用微生物发酵床养猪垫料为发酵培养基主成分，固态发酵无致病力青枯菌FJAT-1458，活菌量达4.68×108CFU/g。本论文以巨菌草渣为发酵培养基主成分，通过正交试验优化菌株FJAT-aRS01 固态发酵培养基和发酵条件，确定其最佳培养基配方为巨菌草渣36.36%、玉米粉27.27%、米糠27.27%和稻壳9.09%；最佳发酵条件为接种量15%，料水质量比为1:0.8，装袋量为150 g/袋，发酵时间为48 h，在此培养基配方和发酵条件下，FJAT-aRS01 的固态发酵物平均活菌量为1.80×109CFU/g，与陈燕萍等[20]研究结果相比，活菌量增加近4 倍。

为了能够在茄果类蔬菜生产过程中安全、有效地利用FJAT-aRS01 的固态发酵物，本论文系统地研究了FJAT-aRS01 固态发酵物对茄果类蔬菜种子萌发、植株生长的影响及青枯病的防治效果：FJAT-aRS01固态发酵物对种子萌发的影响与浸提液浓度（低浓度促进，高浓度抑制）密切相关，这与陈燕萍等[20]、魏云霞等[25]研究结果一致；FJAT-aRS01 固态发酵物浸提液的50 倍稀释液能促进番茄种子萌发，其100 倍稀释液能促进辣椒和茄子种子萌发，且种子发芽率、发芽指数和种子活力数均显著高于对照（发芽指数既可反映发芽的速度，也可反映发芽的整齐程度[26]。种子活力指数是种子发芽速率和生长量的综合反映[27]）；在栽培基质中添加质量百分比≤15%的FJAT-aRS01 固态发酵物能促进植株生长，添加质量百分比25%的FJAT-aRS01 固态发酵物对于番茄、辣椒和茄子青枯病的防效均达75%以上，且防效随添加量增大而增加，这与刘波等[28]研究结果相吻合。

综上所述，低浓度FJAT-aRS01 固态发酵物会促进番茄、辣椒和茄子种子萌发和植株生长，而高浓度FJAT-aRS01 固态发酵物则会抑制种子萌发和植株生长。对于番茄，FJAT-aRS01 固态发酵物添加量为5%时促生效果最好，对于辣椒和茄子，添加量10%促生效果最好，但FJAT-aRS01 固态发酵物添加量为25%时，对这3 种作物青枯病的防效均为最好。因此，在生产应用中应根据不同作物，兼顾植株生长和防效，适宜添加FJAT-aRS01 固态发酵物。本论文仅对FJAT-aRS01 固态发酵物进行室内促生防病方面研究，其作用机理及田间应用效果有待进一步研究。