全局调控子MtrAsbh影响米尔贝霉素生物合成的研究

祝亚杰，王佳彬，李珊珊，向文胜,2*，张艳艳*

（1.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193；2.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

微生物天然产物农药具有高效、低毒、环境相容性好的特性，在农作物病虫害绿色防控和保障粮食安全等领域具有重要的战略地位。链霉菌是天然产物农药的主要来源之一[1]，例如，可可链霉菌Streptomyces cacaoi可以产生能够防治水稻纹枯病和其它真菌病害的多氧霉素；吸水链霉菌井冈变种Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis5008 可以产生井冈霉素用于防治水稻纹枯病；阿维链霉菌Streptomycesavermitilis能够产生广谱杀虫剂阿维菌素，用于粮食作物，蔬菜和水果等的害虫防治；春日链霉菌Streptomyceskasugaensis和小金色链霉菌Streptomycesmicroaureus能够产生可以防治水稻稻瘟病的春雷霉素。此外，我们所熟知的中生菌素、武夷菌素、宁南霉素和本研究团队具有自主知识产权的米尔贝霉素等也分别是由不同链霉菌所产生的天然产物农药。值得注意的是，天然产物农药并非链霉菌生长所必需，其产生和产量受到细胞复杂调控网络的严谨控制，往往发酵产量低，严重制约了天然产物农药的产业化开发和应用[2,3]。造成这一问题的主要原因之一便是对菌株天然产物生物合成调控机制认知的不足，导致可用于高产菌株改造的有效靶点相对匮乏。因此，聚焦于天然产物农药生物合成调控研究，探寻有助于米尔贝霉素产量提高的有效靶点，对于构建高产工程菌具有重要意义。

米尔贝霉素（milbemycin A3/A4）是由链霉菌所产生的十六元大环内酯类化合物（图1），是一种具有高效杀虫、杀螨活性，且环保、低毒的绿色生物农药，能够防治对有机磷农药和阿维菌素产生抗性的螨，粉虱和蚜虫等多种农业害虫，具有广阔的应用前景[4]。冰城链霉菌是米尔贝霉素的重要产生菌，多年来，本研究团队在米尔贝霉素生物合成调控研究中取得一系列研究进展，报道了多个影响米尔贝霉素产生的正调控子（MilR、SbbR 和KelR）和负调控子（SbbA、SbrH1-R 和SspH）[2,4-7]，并对相应调控机制进行了深入研究，一定程度上丰富了我们对米尔贝霉素生物合成调控网络的了解，同时也提供了多个可用于菌株高产改造的有效靶点。然而，冰城链霉菌中存在大约600 个调控因子编码基因[8]，且绝大多数功能未知。若能从这些功能未知的大量调控因子中筛选能够影响米尔贝霉素产生的调控蛋白，将加深我们对米尔贝霉素调控网络的认知，也为高产工程菌的构建提供更多可供选择的靶点。

图1 Milbemycin A3 和A4 的化学结构Fig.1 The chemical structures of milbemycin A3 and A4

双组份信号转导系统（Two-component system，TCS）在链霉菌天然产物生物合成调控中发挥着重要作用。近年来，研究者们在链霉菌中发现了一对高度保守的TCS MtrAB，其在DNA 复制、细胞分裂和天然产物产生过程中发挥着关键作用[9,10]。该TCS 中应答调控蛋白组分MtrA 能够直接控制委内瑞拉链霉菌Streptomycesvenezuelae中氯霉素生物合成基因簇的表达[9]，还能够直接调控天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor中放线紫红素和十二烷基灵菌红素生物合成基因簇的表达[10]；有趣的是，过表达mtrA能够显著促进氯霉素，放线紫红素和十二烷基灵菌红素的产生，表明操作mtrA的表达水平可用于提高链霉菌中天然产物的产生。因此，在本工作中，我们对mtrA在冰城链霉菌中的功能进行了探究。MtrAsbh为米尔贝霉素生物合成的关键激活子，能够间接影响米尔贝霉素生物合成基因簇的表达水平；mtrAsbh过表达后能够通过上调米尔贝霉素生物合成基因簇和前体合成相关基因的表达来促进米尔贝霉素的产生。mtrAsbh缺失后，冰城链霉菌基因组中许多天然产物生物合成基因表达水平也表现出显著下调或上调趋势。相关研究不仅丰富了对米尔贝霉素调控网络的认知，为米尔贝霉素高产菌株改造提供有效靶点，同时也为挖掘新型天然产物提供了改造靶点。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及引物

本文使用的主要研究材料为米尔贝霉素产生菌——冰城链霉菌野生型菌株BC-101-4，该菌株为本实验室保存。用于基因操作和蛋白异源表达的大肠杆菌JM109、ET12567/pUZ8002、BL21（DE3）均为实验室保存。大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139（AprRr）用于基因敲除。pSET152::PhrdB为本实验基于链霉菌整合型质粒pSET152 构建的用于基因回补或者过表达的通用质粒（目的基因由组成型hrdB启动子启动表达）。pET23b(+)为蛋白异源表达用质粒。本文所用引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，具体序列见表1 和表2。

表1 本研究遗传操作及体外试验所用引物Table 1 Primers for genetic manipulation and in vitro experiments in this study

1.2 培养基和培养条件

冰城链霉菌产孢和种子液培养使用的培养基都为SSPY，接合转移用培养基为MS，发酵用培养同前期报道[4]。大肠杆菌使用LB 培养基培养。链霉菌培养温度为28 ℃，大肠杆菌培养温度为37 ℃。

1.3 试剂、酶、抗生素及使用浓度

质粒提取试剂盒、DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR 产物回收试剂盒、DNA marker 及蛋白marker均购买于北京全式金生物有限公司；DNA 聚合酶KOD plus 购买于TOYOBO 公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 购买于New England Biolabs 公司；T4 DNA 连接酶购买于Thermo Fisher 公司；RNA 提取试剂盒购买于康为世纪生物科技有限公司；RNA 清除反转试剂盒购买于天根生物科技有限；荧光定量用试剂PowerUp™ SYBR® Green Master Mix 购买于赛默飞世尔科技有限公司；凝胶阻滞用染料SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain 购于Invitrogen 公司；Gibson 组装所用试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司；高效液相分析所用甲醇、乙醇为色谱纯，购买于美国Fisher 公司。其余化学试剂均购买于国药集团化学试剂公司。安普霉素（100 mg/mL，水）、氯霉素（25 mg/mL，100%乙醇）、氨苄青霉素（100 mg/mL，水）和萘啶酮酸（25 mg/mL，0.1 mol/L NaOH）作为贮备液冷冻保存。在LB 培养基中，安普霉素、氯霉素和氨苄青霉素的使用浓度分别为100 μg/mL、25 μg/mL 和100 μg/mL。冰城链霉菌接合转移用MS 和产孢培养基上安普霉素使用浓度都为6 μg/mL，萘啶酮酸使用浓度为25 μg/mL。

1.4 DNA 基本操作与分析

常见的分子生物学操作方法见分子克隆指南[11]，链霉菌基因组提取见链霉菌操作手册[12]。

1.5 基因敲除、回补与过表达的构建

为构建mtrAsbh缺失突变株，以冰城链霉菌BC-101-4 基因组为模板，使用引物6494-upF/6494-upR 和6494-downF/6494-downR 分别PCR 扩增mtrAsbh的上游（约2.1 kb）和下游（约2.2 kb）片段，然后将这两个片段通过 Gibson 组装连入pKC1139 的HindIII 和EcoR I 位点，得到mtrAsbh无痕敲除质粒pKC1139::ΔmtrAsbh。将该质粒转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，进而通过接合转移[13]转入野生型菌株BC-101-4 中，得到具有安普霉素抗性的接合子。pKC1139 为温度敏感型复制子，高于34 ℃不能自主复制。因此将收集到的孢子适量涂布于安普霉素抗性MS 平板中，37 ℃培养 9 d。随后，收集孢子（此时孢子为基因敲除质粒至少一侧同源臂发生了同源重组）均匀涂布于无抗生素的固体SSPY 培养基上[4]，28 ℃连续传3代，期间游离的pKC1139 基因敲除质粒丢失，与基因组发生同源重组的敲除质粒则发生第2 次同源重组。将传代3 次的孢子制备孢子悬浮液，梯度稀释涂布于无抗SSPY 平板上，将长出来的单克隆分别转接入含安普抗性和无抗的固体SSPY 平板，挑选在抗性平板上不长，而在无抗平板上生长的单克隆。这样的单克隆是发生两次双交换的，可能是突变株，也可能恢复为野生型，因此将进一步提取单克隆基因组作为模板，设计两个同源臂更外侧的引物（con6494F/R）进行 PCR 扩增和 DNA 测序，筛选正确的mtrAsbh无痕敲除菌株。同样以冰城链霉菌BC-101-4 基因组为模板，使用引物对O6494-F/R 通过PCR 扩增含mtrAsbh编码框序列的片段，然后将其通过Gibson 组装连入整合型载体pSET152::PhrdB，获得回补或者过表达用载体pSET152::PhrdB::mtrAsbh。将该质粒转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，进而通过接合转移[13]导入mtrAsbh缺失株（ΔmtrAsbh）和野生型菌株BC-101-4 中获得回补菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh和过表达菌株OmtrAsbh。

1.6 冰城链霉菌米尔贝霉素的发酵和HPLC 分析

米尔贝霉素发酵和HPLC 分析方法参照文献方法[4]进行。

1.7 MtrAsbh 在大肠杆菌的表达及纯化

以冰城链霉菌野生型BC-101-4 基因组为模板，使用引物对MtrAEP-F/R PCR 扩增MtrAsbh编码序列。将获得的编码序列片段通过Gibson 组装方式连入pET23b(+)的NdeI/HindIII 位点，得到蛋白表达载体pET23b::MtrAsbh。后续的蛋白异源表达和纯化参照文献[14]方法进行。

1.8 转录分析和凝胶阻滞试验

收集米尔贝霉素发酵3 d 和6 d 的菌体提取总RNA，cDNA 合成和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）操作步骤参考文献[13]方法。凝胶阻滞试验使用荧光染料法。使用的启动子探针通过PCR 和胶回收制备。凝胶阻滞反应体系参考文献[13]方法，其中，20 µL 反应体系中启动子探针的浓度调整为20 ng。反应体系配置完毕室温25 ℃反应25 min，然后通过4.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳分析。电泳结束后，将胶置于10000 倍稀释的SYBR Gold 染料溶液（0.5×TBE 缓冲液）中避光振荡染色30 min 后用凝胶成像系统进行拍摄。

2 结果与分析

2.1 冰城链霉菌中MtrA 同源蛋白序列分析

为研究冰城链霉菌中MtrA 的功能，首先通过生物信息学分析找到基因组中对应的同源蛋白编码基因。利用天蓝色链霉菌基因组 MtrA（SCO3013）氨基酸序列进行BLAST 分析，发现冰城链霉菌基因组中对应的同源蛋白编码基因为sbi_06494，此处将其命名为mtrAsbh。mtrAsbh编码产物MtrAsbh由225 个氨基酸组成，预测分子量为24.8 kDa。MtrAsbh与来自于天蓝色链霉菌、委内瑞拉链霉菌和结核分枝杆菌H37Rv 中的MtrA同源蛋白一致性分别为99%、99%和75%（图2）。

图2 不同菌株来源MtrA 同源蛋白的氨基酸序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment of the MtrA homologs from different bacterial species

2.2 mtrAsbh 是米尔贝霉素合成的正调控基因

基因的表达时序与其功能存在一定关联性。从冰城链霉菌野生型BC-101-4 的时序转录组数据（GSE147644）中抽提出mtrAsbh表达时序相关信息，并对获得的对应FPKM 值（代表基因表达水平）进行分析。如图3A 显示，mtrAsbh在0.75 d 时的转录丰度最强，随后转录丰度下降，但仍保持着较高的转录水平，即从米尔贝霉素产生初期（3 d）直至发酵结束（9 d），mtrAsbh转录本丰度一直维持在其在0.75 d时表达水平的一半左右。这表明MtrAsbh可能在整个发酵过程中都发挥一定的作用。紧接着，为了确定mtrAsbh的功能，我们构建了mtrAsbh同源重组缺失菌株ΔmtrAsbh。在ΔmtrAsbh中，mtrAsbh编码框内部456 bp编码序列被删除（图3B）。随后将获得的ΔmtrAsbh连同野生型BC-101-4 进行米尔贝霉素发酵和HPLC 分析。结果表明mtrAsbh缺失后，菌株失去米尔贝霉素A3/A4 产生能力（图3C）。为确定ΔmtrAsbh中米尔贝霉素不产生是由mtrAsbh缺失所导致的，进行了mtrAsbh回补试验。将含有完整mtrAsbh编码框的678 bp 序列进行PCR 扩增并将其连入含有hrdB启动子（PhrdB）的整合型质粒pSET152::PhrdB中，获得回补质粒pSET152::PhrdB::mtrAsbh。将该质粒通过接合转移导入ΔmtrAsbh获得回补菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh，并对其进行米尔贝霉素产量分析。结果表明回补菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh中米尔贝霉素A3/A4 产量恢复到BC-101-4 水平的70%左右（图3C）；与此同时，还测定了野生型、突变株和回补菌株在发酵过程中的菌体生长情况，结果显示ΔmtrAsbh生物量显著低于BC-101-4，而回补菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh的生物量则与BC-101-4 生物量基本一致（图3D）。以上结果表明，MtrAsbh正调控米尔贝霉素的生物合成和细胞生长。

图3 mtrAsbh 对米尔贝霉素产生和细胞生长的影响Fig.3 Effects of mtrAsbh on milbemycin production and cell growth

2.3 MtrAsbh 间接正调控了米尔贝霉素生物合成基因簇的表达

为了确定MtrAsbh是否影响米尔贝霉素生物合成基因簇的表达，提取了BC-101-4 和ΔmtrAsbh发酵3 d和6 d 的菌体总RNA，并进行反转录和实时荧光定量试验，分析基因簇中代表性基因milA2、milA4、milF、milR和milA1的表达情况。图4A 结果显示，与BC-101-4 相比较，ΔmtrAsbh中这5 个基因的转录丰度都大幅下调甚至不表达。这些结果表明，MtrAsbh能够通过激活米尔贝霉素生物合成基因簇的表达而正调控米尔贝霉素的产生。为了确定MtrAsbh对米尔贝霉素生物合成基因簇表达的调控是直接还是间接作用，首先参照已经报道的MtrA 保守结合基序（17 bp 不完美正向重复序列：G/T-T-G/A-A-C-C-N5-G-T-G/T-A-C-N）[15]对米尔贝霉素基因簇启动子区域进行仔细分析；我们在3 个关键基因的启动子区发现了与该保守结合基序有一定相似性的序列，它们分别位于milA4启动子区（5′-GTGCTTAGGGGGTGCAG-3′），milF启动子区（5′-GTCTT GAGGGGGTTCCG-3′）和milR启动子区（5′-GTGAGCCACAAGTTGAT-3′，5′- GTCCGGAACCAGTCAT G-3′，5′-GTTTCAGGCGTGTCATC-3′）。然后，为了验证MtrAsbh是否与这些启动子存在直接相互作用，在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达了带有His6标签MtrAsbh蛋白，并通过凝胶阻滞实验检测MtrAsbh与这些启动子区域的相互作用情况。于此同时也检测了不含有该序列特征的启动子区（PmilA2和PmilA1）与MtrAsbh的结合情况。在具体的凝胶阻滞试验中以hrdB启动子（PhrdB）作为负对照，选择与PhrdB不结合的蛋白浓度进行相互作用试验。结果显示在此浓度范围内，MtrAsbh不能够与米尔贝霉素基因簇中任何一个启动子区域结合（图4B）。我们猜测虽然PmilA4，PmilF和PmilR的启动子区含有与MtrA 保守结合基序相似的序列，但是序列相似性偏低，这可能是导致不结合的原因之一。以上结果表明MtrAsbh可能间接正调控了米尔贝霉素生物合成基因簇的表达。

图4 MtrAsbh 对米尔贝霉素生物合成基因表达的影响Fig.4 Effects of MtrAsbh on the expression of milbemycin biosynthesis genes

2.4 mtrAsbh过表达增强了米尔贝霉素生物合成基因簇和前体合成相关基因的表达，并促进米尔贝霉素的产生

如上所述，MtrAsbh是米尔贝霉素生物合成基因簇的激活子，因此推测mtrAsbh过表达可能有助于米尔贝霉素产量的提高。于是将构建的质粒pSET152::PhrdB::mtrAsbh通过接合转移导入BC-101-4 中获得过表达菌株OmtrAsbh，并对其进行米尔贝霉素产量分析。结果表明与BC-101-4 相比较，获得的5 株过表达菌株中米尔贝霉素产量提高幅度为32%～40%（图5A）。由此可见，mtrAsbh是提升米尔贝霉素产量的有效靶点。为了确定mtrAsbh过表达后对米尔贝霉素生物合成基因簇表达的影响。提取BC-101-4 和过表达菌株OmtrAsbh发酵第3 d（米尔贝霉素产生初期）的总RNA 样品进行转录分析。结果显示在过表达菌株OmtrAsbh中，mtrAsbh表达丰度显著提高，表明mtrAsbh过表达成功；同时，米尔贝霉素生物合成基因簇中的5 个重要基因（milA2、milA4、milF、milR和milA1）也表现出不同程度的显著上调（图5B），说明mtrAsbh过表达显著强化了米尔贝霉素生物合成基因簇的表达水平。

图5 mtrAsbh 过表达对米尔贝霉素A3/A4 产量，米尔贝霉素基因簇和前体合成相关基因表达的影响Fig.5 Effects of mtrAsbh overexpression on production of milbemycin A3/A4, and on expression of milbemycin biosynthetic gene cluster and genes related to precursor supply

MtrAsbh是保守的全局性调控子，在液体发酵条件下能够影响菌体生长（图3D）。由于菌体生长也是初级代谢的一部分，因此推测mtrAsbh过表达也可能通过影响初级代谢，继而影响前体供给来调控米尔贝霉素产生。为了验证猜测，紧接着分析了冰城链霉菌中影响丙二酸单酰辅酶A 和甲基丙二酸单酰辅酶A（这两种化合物均为米尔贝霉素合成关键延伸单元）合成的关键基因的表达情况。图5C 结果显示，负责丙二酸单酰辅酶A 合成的sbi_02769、sbi_02770和sbi_08290在OmtrAsbh中是显著高表达的；甲基丙二酸单酰辅酶A 合成基因sbi_4601在OmtrAsbh中也有显著上调。这表明MtrAsbh能够通过影响前体合成相关基因的表达进而影响米尔贝霉素的合成。

2.5 MtrAsbh 差异化调控基因组中多个天然产物生物合成核心基因的表达

链霉菌不仅能够产生很多结构已知的天然产物，其基因组中还编码有大量结构和功能未知的天然产物生物合成基因簇，被称为隐性基因簇。这些隐性基因簇的表达水平较低或是不表达是导致相应化合物不能够被检测出的主要原因之一[3]。聚酮（polyketides，PKS）、非核糖体肽（Nonribosomal peptides，NRPS）和聚酮-非核糖体肽（PKS-NRPS）是链霉菌基因组中存在的三种主要类型的天然产物生物合成基因簇。冰城链霉菌基因组中大约有31 种上述类型的天然产物基因簇[7]。为确定MtrAsbh对这些天然产物基因簇表达的影响，选取天然产物基因簇中决定产物合成的核心基因，并检测它们在mtrAsbh缺失后表达水平的变化情况。图6 结果表明，删除mtrAsbh后，31 个生物合成核心基因中有12 个基因（sbi_00140、sbi_00220、sbi_00319、sbi_00522、sbi_00625、sbi_01983、sbi_02068、sbi_02764、sbi_08414、sbi_09249、sbi_09652和sbi_10015）的表达水平在第3 d 和第6 d 时都表现出显著下调甚至不表达的趋势，表明MtrAsbh是这些基因的关键激活子；值得注意的是，少数基因表达水平表现出显著上调趋势，如sbi_00822表达水平在第3 d 和第6 d 分别上调约15 倍和100 倍；sbi_01029表达水平在第3 d 和第6 d 分别上调约2 倍和9 倍；sbi_00655和sbi_00671表达水平在第3 d 和第6 d 也都有显著上调；sbi_02232在第6 d 时表达水平上调约100 倍；此外，在第6 d时，sbi_06873、sbi_008957和sbi_09195等基因表达也表现出显著上调的趋势，这表明MtrAsbh也是某些天然产物合成基因的重要负调控子。以上结果表明MtrAsbh对多数天然产物生物合成基因具有正调控作用，同时还能负调控少数天然产物合成基因的表达，也就是说MtrAsbh对不同的天然产物合成基因表达表现出差异化调控作用。

图6 mtrAsbh 缺失对冰城链霉菌基因组中其它天然产物合成基因表达的影响Fig.6 Effects of mtrAsbh deletion on expression of other natural product biosynthesis genes present in the genome of Streptomyces bingchenggensis

3 讨论

链霉菌源天然产物农药因其高效，广谱，低毒的特性在植物病虫害绿色防控中具有非常重要的作用[14]。提高优质天然产物农药的产量是实现其产业化生产和应用过程中不可或缺的一个环节。然而，链霉菌中天然产物农药的产生受到细胞复杂转录调控网络的严谨控制，往往产量较低[3,16]。因此，聚焦于寻找影响天然产物农药产生的新颖调控因子，解析其影响产物产生的机制，对于挖掘高产有效靶点和构建高产工程菌具有积极的推动作用[7]。在本研究中，基于文献调研和试验研究，我们鉴定了一个影响米尔贝霉素产生的重要调控因子——MtrAsbh。mtrAsbh敲除后，菌株彻底失去米尔贝霉素产生能力，而高表达mtrAsbh则可明显促进米尔贝霉素的产生。进一步研究发现MtrAsbh可通过影响米尔贝霉素生物合成基因簇和前体合成相关基因的表达而调节米尔贝霉素的产生。此外，我们还发现MtrAsbh虽然是很多天然产物生物合成基因的正调控因子，其失活后，还有少数天然产物生物合成基因表达水平显著上调。这些结果不仅为米尔贝霉素高产菌构建提供有效靶点，同时也为发现新的天然产物提供操作靶标。

MtrA 首先是在结核分枝杆菌中被发现的，在DNA 复制和细胞分裂中发挥着关键作用[17]。后来有研究者发现MtrA 在放线菌中也是高度保守存在的，并在菌株发育分化和天然产物生物合成过程中发挥重要作用[9]。在委内瑞拉链霉菌中，MtrA 不仅可以直接控制DNA 复制和细胞分裂相关基因的表达，还能够直接结合在氯霉素生物合成基因簇中cmlN-cmlF启动子区进而正调控氯霉素的产生。在天蓝色链霉菌中，MtrA可以直接作用于actII-1、actII-4和redZ的启动子区，进而直接调节放线紫红素和十二烷基灵菌红素的产生。以上报道说明MtrA 可能在链霉菌中具有普遍调节天然产物产生的功能。在本研究中，我们通过详细研究表明MtrAsbh为米尔贝霉素产生的关键激活子，且mtrAsbh高表达可通过强化米尔贝霉素基因簇和前体合成相关基因的表达而促进米尔贝霉素产量的提高。因此，mtrAsbh可以作为米尔贝霉素增产的有效靶点，在未来菌株生产性能的系统改造过程中发挥重要作用。

链霉菌基因组中存在的大量隐性基因簇是天然产物的宝库。如何激活这些隐性基因簇的表达是寻找新颖天然产物必须解决的问题之一。然而，这些隐性基因簇同样受到细胞复杂转录调控网络的严谨控制，导致表达水平较低甚至不表达。因此，破解这个复杂转录调控网络，特别是寻找能够广泛控制隐性基因簇表达的调控因子，对于开发能够促进隐性基因簇高表达的有效策略非常必要。在本研究中，我们发现MtrAsbh不仅是米尔贝霉素和多个潜在天然产物生物合成核心基因的正调控子，敲除mtrAsbh还能够上调基因组中其它一些隐性基因簇生物合成核心基因的表达，这表明MtrAsbh差异化影响了天然产物生物合成基因簇的表达，该发现为新型天然产物挖掘提供操作靶点。