ALS抑制类除草剂对西瓜子叶外植体分化的研究

万丽丽 王转茸 汤谧 曾红霞 张学军 张娜 任俭 孙玉宏 朱志坤

摘要：以西瓜自交系D66的子叶为外植体，将外植体置于含有不同浓度乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）抑制剂类除草剂（SU除草剂、IMI除草剂）的筛选培养基上，根据外植体的分化率确定最适宜的除草剂浓度。探讨不同植物生长调节剂（6-BA、NAA）浓度配比对不定芽的增殖作用。结果表明，SU除草剂中苯磺隆和噻吩磺隆的最适宜浓度均为0.25 mg/L，苄嘧磺隆的最适宜浓度为0.50 mg/L；IMI除草剂中灭草喹和灭草烟的最适宜浓度均为1.50 mg/L；在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培养基中不定芽的增殖率最高，为287.0%；根据西瓜自交系材料D66确定的除草剂最适宜浓度同样适用于西瓜杂交种（武农8号、黑美人、甜王1号、早佳8424）子叶外植体的筛选试验。

关键词：子叶外植体；ALS抑制类除草剂；西瓜自交系；西瓜杂交种；不定芽增殖；SU除草劑；IMI除草剂

中图分类号：S651         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）11-0202-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.11.035 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the differentiation of watermelon cotyledon explants by ALS inhibitor herbicides

WAN Li-li1， WANG Zhuan-rong1， TANG Mi1， ZENG Hong-xia1， ZHANG Xue-jun2，3，

ZHANG Na1， REN Jian1， SUN Yu-hong1， ZHU Zhi-kun4

（1. Wuhan Academy of Agricultural Sciences， Wuhan  430065，China；2. The Research Center of Hami-melon， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi  830091，China；3. Hainan Sanya Crop Breeding Experimental Center，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Sanya  572014，Hainan，China；4.Caidian District Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Wuhan  430199，China）

Abstract：Using the cotyledons of watermelon inbred line D66 as explants， the explants were placed on a screening medium containing different concentrations of acetolactate synthase （ALS） inhibitor herbicides （SU herbicides， IMI herbicides）， and the optimal herbicide concentration was determined based on the differentiation rate of the explants. The effect of different plant growth regulators （6-BA， NAA） concentration ratios on the proliferation of adventitious buds was explored. The results showed that the optimal concentrations of tribenuron-methy1 and thifensulfuron-methy1 in SU herbicides were both 0.25 mg/L， while the optimal concentration of bensulfuron was 0.50 mg/L；the most suitable concentrations for IMI herbicides such imazaquin and imazapyr were both 1.50 mg/L；the highest proliferation rate of adventitious buds was observed in MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA medium， which was 287.0%；the optimal concentration of herbicides determined based on watermelon inbred line D66 materials was also suitable for screening cotyledon explants of watermelon hybrids （Wunong 8， Black Beauty， Tianwang 1， Zaojia 8424）.

Key words： cotyledon explants； ALS inhibitory herbicides； watermelon inbred line； watermelon hybrid； adventitious bud proliferation； SU herbicides； IMI herbicides

人口的增长和极端气候环境给农作物的生产带来挑战，提高作物的产量和对逆境胁迫的适应性是育种工作者需要重点关注的问题。田间杂草与农作物竞争光照、水肥和氧气，影响农作物的产量和品质［1］。化学除草是现代农业生产中控制杂草的主要手段。乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）抑制剂类除草剂具有广谱性、活性高、选择性强和生物安全性高的优势，在田间杂草防控中被广泛应用。主要包括5个不同结构的化合物家族，分别是磺酰脲类（Sulfonylureas，SU）、咪唑啉酮类（Imidazolinones，IMI）、三唑嘧啶磺酰胺类（Triazolopyrimidines，TP）、嘧啶水杨酸类（Pyrimidyl-benzoates，PB）和磺酰氨羧基三唑啉酮类（Sulfonlyaminocarbonyl-triazolinones，SCT）［2］。SU和IMI是常用的除草剂，这2类除草剂主要用于1年生或多年生阔叶杂草的防除。SU除草剂主要有苯磺隆（Tribenuron-methyl，TM）、噻吩磺隆（Thifensulfuron methyl，HAR）、苄嘧磺隆（Bensulfuron methyl，BM）等。IMI除草剂主要有灭草烟（Imazethapyr，IP）和灭草喹（Imazaquin，IQ）等。ALS抑制类除草剂的作用靶标是植物内源ALS，通过阻断底物进入ALS酶的活性位点并与之结合，进而影响缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸的生物合成，影响植物体内的蛋白代谢，最终灭杀植物［3］。尽管ALS抑制剂类除草剂具有诸多优势，但其作用位点单一、长期高频施用容易产生杂草耐受性，进而产生抗药性杂草种群。

植物对ALS抑制剂类除草剂产生的抗性机制如下。①靶标抗性（Target-site resistance，TSR）。靶标基因ALS保守区域发生突变引起氨基酸的改变，导致酶结构或者空间构象变化，对除草剂的敏感性降低进而产生抗性。ALS蛋白质的研究发现，A96、P171、A179、W548和S627 5个高度保守结构域中氨基酸突变会提高植株对除草剂的抗性［4，5］。②非靶标抗性（Non-target-site resistance，NTSR）。通過减少除草剂的吸收、转运和活化能力提高除草剂解毒、降解和诱导损伤修复能力［6］。细胞色素P450单氧化酶、谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferase， GSTS）和糖基转移酶等通过催化除草剂脱烷基化、环甲基羟基化、芳环的羟基化、脱硫氧化，或者催化有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联增加疏水性，使有害物质更容易穿透细胞膜分解排出［7-9］。基于抗ALS抑制剂类除草剂的作用机理，通过多途径获得新型ALS抑制剂类除草剂抗性资源是解决杂草抗药性的有效策略。目前有学者已经通过种子EMS诱变与除草剂筛选相结合、植株体细胞或者小孢子细胞与除草剂共培养等方式获得自发突变的抗性种子和抗性细胞系［10-12］。随着生物技术的快速发展，利用转基因和基因编辑技术实现ALS与除草剂结合位点的突变，快速创制抗除草剂的种质［13-16］。玉米ALS基因165位Ser替换为Pro，获得抗氯磺隆除草剂的玉米种质，西瓜内源ALS基因190位Pro替换为Ser，获得抗除草剂的西瓜种质［17］。此外，随着基因编辑工具的优化，利用单碱基编辑器构建ALS基因饱合突变体库能够快速获得抗除草剂的基因资源。利用农杆菌介导的遗传转化方法，在含有适宜除草剂浓度的培养基上筛选植物的外植体，能够获得抗ALS抑制类除草剂的新种质资源［18-20］。遗传转化的程序包含农杆菌侵染、共培养、选择培养、分化培养和植株再生等，遗传转化后的组织培养程序中可以施加不同类型的ALS抑制类除草剂，作为再生细胞的选择剂，经过分化培养获得抗不同类型除草剂的再生植株。不同的作物种类、外植体类型对除草剂的敏感性存在差异，筛选适宜的除草剂浓度对鉴定抗除草剂种质资源显得尤为重要。

本研究以西瓜子叶为试验材料，置于不同浓度ALS抑制类除草剂的培养基中，研究除草剂对西瓜组织培养外植体再生的影响，为建立高效的西瓜抗除草剂遗传转化体系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为西瓜自交系D66、西瓜杂交种（武农8号、黑美人、甜王1号、早佳8424）。

1.2 试剂

MS培养基（含维生素）购自荷兰Duchefa公司；植物生长调节剂6-BA（1 mg/mL）和IAA（1 mg/mL）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂粉Agar［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］、抑菌剂特美汀均购自上海泰坦科技股份有限公司；ALS抑制类除草剂磺酰脲类的苯磺隆、噻吩磺隆 、苄嘧磺隆和咪唑啉酮类的灭草喹、灭草烟均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ALS抑制类除草剂的配制 分别称取10 mg 苯磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、灭草烟和灭草喹固体粉末，用100 μL 2 mol/L NaOH液体溶解，最后用去离子水定容。

1.3.2 除草剂筛选 西瓜种子置于75%乙醇中消毒30 s，1.5%次氯酸钠消毒20 min，无菌去离子水冲洗3～5次，接种于MS+0.45 mg/L 6-BA培养基，26 ℃暗培养2～3 d直至胚根伸长至0.2～0.5 cm。从子叶和胚根接触位置切开，去除子叶远轴端1/3的部分，将剩下的2/3子叶作为外植体。将外植体转移至除草剂筛选培养基（MS+1.0 mg/L 6-BA+除草剂+0.8 g/L Agar+200 mg/L 特美汀培养基），其中除草剂分别为TM、HAR、BM、IQ和IP。SU除草剂设置不同浓度（A=0.01 mg/L、B=0.05 mg/L、C=0.25 mg/L、D=0.50 mg/L），苯磺隆除草剂对应的筛选培养基分别为TMA、TMB、TMC、TMD，噻吩磺隆除草剂对应的筛选培养基分别为HARA、HARB、HARC、HARD；苄嘧磺隆除草剂对应的筛选培养基分别为BMA、BMB、BMC、BMD。IMI除草剂设置不同浓度（a=0.25 mg/L、b=0.50 mg/L、c=1.00 mg/L、d=1.50 mg/L），灭草喹除草剂对应的筛选培养基分别为IQa、IQb、IQc、IQd；灭草烟除草剂对应的筛选培养基分别为IPa、IPb、IPc、IPd。不含有除草剂的培养基为对照（CK）。组织培养的温度为（25±2） ℃，光照度为1 500～3 000 lx，16 h光照、 8 h黑暗培养。每个处理3次重复，分别在培养10、25、35 d后记录外植体的分化率，计算公式如下：

分化率=（分化出愈伤数或者不定芽的外植体数/接种外植体总数）?100%  （1）

死亡率=（外植体死亡数/接种外植体总数）?100%            （2）

1.3.3 西瓜子叶诱导不定芽 将诱导生成的1～2 cm不定芽转移到含有不同浓度6-BA和NAA的MS培养基中，其中，6-BA浓度分别为0.5、1.0、2.0 mg/L，NAA浓度分别为0.1、0.5、1.5 mg/L。每个处理接种6～8个不定芽，3次重复。30 d后统计芽增殖率，计算公式如下：

芽增殖率=（新增出芽数/原有芽数）?100%  （3）

1.3.4 数据分析 试验数据用Excel 2017软件统计，在SPSS 26.0软件中采用Duncans法进行多组样本间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 SU除草剂对西瓜子叶外植体的分化作用

将西瓜自交系D66的子叶作为外植体置于不同类型和浓度的SU除草剂筛选培养基，10、25、35 d后统计外植体的分化率和死亡率（图1）。由表1、表2、表3可知，随着SU除草剂浓度的增加，外植体死亡率呈上升趋势，分化率呈下降趋势。外植体在0.25 mg/L苯磺隆培养基上培养10 d后，外植体的分化率为0，培养 35 d后外植体的死亡率为42.0%；外植体在0.25 mg/L噻吩磺隆培养基上培养10 d后，外植体的分化率为0，培养35 d后外植体的死亡率为55.7%；在0.50 mg/L苄嘧磺隆培养基上培养10 d后，外植体的分化率为0，培养35 d后外植体的死亡率为52.7%。本试验中筛选的是非转基因西瓜材料，外植体没有分化表明该处理下外植体不具备分化能力，为今后开展转基因抗除草剂西瓜种质的筛选提供参考依据。因此将最早出现外植体分化率为0时除草剂的浓度定义为最适宜筛选浓度，苯磺隆和噻吩磺隆除草劑的最适宜筛选浓度均为0.25 mg/L，苄嘧磺隆的最适宜筛选浓度为0.50 mg/L。

2.2 IMI除草剂对西瓜子叶外植体的分化作用

将西瓜自交系D66的子叶作为外植体置于不同类型和浓度的IMI除草剂培养基中。由表4、表5可知，在1.50 mg/L灭草喹除草剂培养基上西瓜子叶外植体的分化率为0，培养35 d后外植体的死亡率达49.3%；在1.50 mg/L灭草烟除草剂培养基上西瓜子叶外植体的分化率为0，培养35 d后外植体的死亡率达45.5%。将最早出现外植体分化率为0时除草剂的浓度定义为最佳筛选浓度，西瓜子叶外植体在灭草喹和灭草烟培养基上筛选浓度均为1.50 mg/L。

2.3 不同植物生长调节剂浓度配比对不定芽增殖培养的影响

6-BA浓度分别为0.5、1.0、2.0 mg/L，NAA浓度分别为0.1、0.5、1.5 mg/L，将诱导生成的不定芽置于不同植物生长调节剂浓度配比的培养基中，由表6可知，不同植物生长调节剂（6-BA、NAA）均能促进不定芽的增殖。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培养基中不定芽的增殖率最高，为287.0%。

2.4 西瓜杂交种的子叶外植体在除草剂培养基上的分化研究

将西瓜杂交种（武农8号、黑美人、甜王1号、早佳8424）和西瓜自交系D66发芽2 d后的子叶作为外植体置于除草剂培养基（表7），35 d后统计4种西瓜杂交种和西瓜自交系D66外植体的分化率和死亡率。4种西瓜杂交种和西瓜自交系D66在0.25 mg/L TM、0.25 mg/L HAR、0.5 mg/L BM、1.5 mg/L IQ和1.5 mg/L IP除草剂培养基中的分化率均为0。西瓜外植体在5种除草剂（TM、HAR、BM、IQ、IP）处理下的死亡率分别为40.0%～50.5%、54.7%～65.0%、40.9%～52.0%、40.7%～52.5%、39.5%～45.2%。

3 结论

1）西瓜自交系D66子叶外植体在含有SU除草剂苯磺隆和噻吩磺隆的培养基上最适宜浓度均为0.25 mg/L，苄嘧磺隆最适宜的浓度为0.50 mg/L。

2）西瓜自交系D66子叶外植体在含有IMI类除草剂灭草喹和灭草烟培养基上最适宜的浓度均为1.5 mg/L。

3）ALS抑制类除草剂筛选后得到的不定芽在含有1.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的培养基中芽增殖率最高。

4）4个西瓜杂交种在0.25 mg/L苯磺隆和噻吩磺隆、0.50 mg/L苄嘧磺隆、1.50 mg/L灭草喹和灭草烟除草剂培养基上的分化率均为0。

4 讨论

农杆菌介导的遗传转化试验中，在培养基中添加筛选剂能够有效抑制非转化细胞或者组织的生长及增殖。目前植物转基因组织培养筛选中常用的选择性标记主要是Kana、Hyg及Basta等。选择性标记能够对转化细胞产生选择压力，致使未转化的细胞不能生长、发育及分化，而转化的细胞能够对除草剂产生抗性。虽然选择性标记基因对筛选转化的细胞及植株提供了便利，但由于它们大多数来自于细菌或者真菌，会产生转基因安全问题。为了便于转基因作物的市场化，研究者倾向于选择来源于植物内源突变的除草剂靶基因表达系统用于转化试验的筛选。ALS抑制类除草剂的作用靶标为ALS，该酶在生物体内能够阻断底物进入酶的活性位点，抑制支链氨基酸的生物合成，破坏生物体的蛋白质代谢反应，最终灭杀植物。采用长期高强度的除草剂选择压或者人工诱变来获得ALS抑制类除草剂的种质。拟南芥、水稻、马铃薯、芥菜型油菜和玉米等作物的ALS基因突变能产生对除草剂的抗性，这类ALS突变基因被选择为遗传转化的筛选标记［21-25］，将水稻OsALS突变基因型作为选择标记应用到大豆、小麦等作物遗传转化试验［26-28］。Kawai等［29］将水稻细胞与ALS抑制类除草剂如双草醚（Bispyribac-sodium）、氯磺隆（Chlorsulfuron）、灭草喹共培养获得自发突变的抗性细胞，设置的筛选浓度为1 nm/L～10 μmol/L。

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