葡萄籽提取物复合膜制备及其抑菌性研究

耿直 付佳乐 郭婉婷

摘要：以壳聚糖和海藻酸钠为成膜材料，以甘油为增塑剂，通过单因素试验，分别考察壳聚糖、海藻酸钠、甘油浓度和葡萄籽提取物添加量对复合膜抗拉伸强度和断裂伸长率的影响，在此基础上建立正交试验进行研究，采用K-B法测定葡萄籽提取物复合膜对大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。结果表明，复合膜最佳成膜工艺为海藻酸钠浓度2.00%、壳聚糖浓度1.50%、甘油浓度0.2%、葡萄籽提取物20%。复合膜对4种控制菌均有抗菌活性，其中对大肠杆菌效果最好，其抑菌圈直径可达7.4 mm，对铜绿假单胞菌的抑菌效果最差。本试验方法简便迅速，所得复合膜稳定，具有一定的力学性能、适宜的透明度和吸水性，加入葡萄籽提取物使复合膜增加抗菌性能，为抗菌复合膜的制备提供一个新的思路，同时为食品保鲜行业膜类产品的制备提供借鉴和参考。

关键词：葡萄籽提取物；壳聚糖；海藻酸钠；复合膜；抑菌

中图分类号：TS206.4         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2023）11-0118-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.11.021 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on the preparation and antibacterial activity of composite films

of grape seed extract

GENG Zhi，FU Jia-le， GUO Wan-ting

（School of Medicine， Shaanxi Institute of International Trade & Commerce， Xian  712046，China）

Abstract：Chitosan and sodium alginate were used as film forming materials and glycerin as the plasticizer. The effects of chitosan， sodium alginate， glycerin concentration and grape seed extract on tensile strength and elongation at the break of composite films were investigated by the single factor test， and the orthogonal test was established on this basis. The antibacterial activity of the composite films of grape seed extract against Escherichia coli， Salmonella， Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus was determined by the K-B method.The results showed that the best composite films forming process was sodium alginate concentration of 2.00%， chitosan concentration of 1.50%， glycerin concentration of 0.2%， and grape seed extract of 20%. The composite films had antibacterial activity against all four control bacteria， with the best effect against Escherichia coli， its antibacterial sphere diameter of 7.4 mm and the worst antibacterial effect against Pseudomonas aeruginosa. The test method was simple and rapid， and the composite films were stable， with certain mechanical properties， appropriate transparency and water absorption. Adding grape seed extract could increase the antibacterial properties of the composite films， which provided a new idea for the preparation of antibacterial composite films and provided reference for the preparation of film products in the food preservation industry.

Key words： grape seed extract；chitosan；sodium alginate；composite films；antibacterial

塑料作為一种材料，因其优异的物理性能、重量轻、加工性能好、经济等优点，广泛应用于食品包装、商品产品、医疗器械和建筑等各领域。塑料的生产一直以每年8.7%的速度呈指数增长，塑料材料中超过40%用于一次性包装的生产［1］。然而大多数塑料材料含不可降解成分，大部分会在环境中扩散、迁移和积累，这将对人类和其他生物造成极大的伤害，如果不经回收处理将会对地球环境造成严重危害。随着“白色污染”越来越受到世界各国的重视，促使全球迫切需要生产环保可再生、生物可降解的生物聚合物材料［2］。因此，以可再生资源为基础的可生物降解包装材料的开发利用越来越引起人们的重视。常见的生物可降解的原料包括多糖、蛋白质和脂类［3］。其中，天然多糖以其良好的生物相容性和生物降解性，以及基于其化学结构的特殊生物功能，如高成膜性、功能性营养特性和化学稳定性等特点，受到人们的亲睐［4］。

殼聚糖（Chitosan，CHI）是由几丁质经脱乙酰化而成的阳离子多糖，在醋酸、盐酸等酸性溶液中易溶解。除溶解性外，还具有无毒、抑菌、生物降解性等特点，是制备食品包装材料的理想原料［5］。然而壳聚糖密度小、溶解度和释放效率较低，且价格相对较高，限制了壳聚糖作为食品包装材料的应用［6］。近年来，有研究表明，依据壳聚糖的多阳离子特性，采用聚电解质复合物（PECs）的压实技术，将两种或多种带有相反电荷的高分子材料，聚电解质之间的静电相互作用而形成复凝聚物进而制备复合膜［7］。海藻酸钠（Sodium alginate，SA）是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic，M）和α-L-古洛糖醛酸（α-Lguluronic，G）以（1→4）键连接设计而成的二元共聚物，为一种具有天然性的阴离子线型多糖，普遍存在于海带、马尾藻等褐藻中，来源丰富，无毒且价格低廉，具有可降解性、安全性、保湿性、成膜性和生物相容性的特点［8］。利用海藻酸钠为阴离子多糖的特性与带有阳离子的壳聚糖发生交联反应从而形成PECs，PECs发生沉淀、累积而成膜。带负电荷的海藻酸钠和带正电荷的壳聚糖可在水溶液中形成聚电解质复合体；当水分蒸发时，可使两天然高分子的链段间形成分子间和分子内氢键或疏水键；当大部分水分蒸发后，可形成致密的三维网状结构而成膜［9］。研究表明，以壳聚糖/海藻酸钠为材料制备复合膜具有较强的拉伸强度和热稳定性，且复合膜的可塑性较好［10］。壳聚糖与海藻酸钠均具备一定抑菌活性，然而有学者研究表明，采用单一的海藻酸钠或壳聚糖为成膜材料的保鲜膜存在一定缺点，如保鲜效果差、对食品的保鲜时效短、保鲜作用不显著等，因此有必要在复合膜中添加抑菌物质［11，12］。通过添加某些天然易得的抑菌剂，可使复合保鲜膜材料获得无毒可食的抑菌性能。植物精油、天然植物提取成分如茶多酚等均具有较高的生物活性和广谱抑菌性，并且天然安全，可以大大弥补单一壳聚糖抑菌膜抑菌活性低的缺点，且降低了壳聚糖膜的透水率［13］。

葡萄籽提取物（Grape seed extract，GSE）是一种天然的保健食品，含有丰富的多酚，尤以原花青素占比最大，葡萄籽中原花青素具有抗氧化、抑菌、治疗心血管疾病、抗衰老及抗溃疡等诸多药理作用，因葡萄籽提取物疗效颇佳、副作用较小等特点已被世界广泛认可，并广泛应用到生活中［14-16］。本研究旨在优化以壳聚糖/海藻酸钠为成膜材料，以甘油为增塑剂，添加葡萄籽提取物混合制备复合膜的工艺变量，并对所制复合膜的物理结构、性能及抑菌活性进行评价，探讨其作为食品包装材料的适用性。同时可为葡萄籽在包装材料中的应用提供有价值的指导，也对新型绿色包装材料的开发有深远的影响。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

葡萄籽提取物（含原花青素不低于98%），香茗生物科技有限公司；壳聚糖、海藻酸钠（食品级，纯度>98%），合肥巴斯夫生物科技有限公司；丙三醇、吐温-80、乙醇、甲醇、冰醋酸、乙醚等（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉（生物试剂），北京奥博星生物技术有限责任公司；高透明亚克力板，广东悦轩达塑胶材料有限公司。

1.2 仪器与设备

754B紫外可见分光光度计，北京普析仪器有限责任公司；E221生物显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司；SN-MS-H280D数显恒温加热磁力搅拌器，山东博科生物产业有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；A8超细匀质机，美国福禄克公司；XLW（PC）薄膜拉力计，济南兰光机电技术有限公司。

2 试验方法

2.1 复合膜制备方法

制备工艺路线［17，18］：原料→称量→溶解→加复合膜液→混合→添加助剂（甘油）→混匀→静置脱气→涂膜→干燥→脱膜→保存备用。

2.1.1 葡萄籽提取物的制备 将葡萄籽进行干燥（55 ℃）后粉碎成粗粉，称取10 g，加75%乙醇超声提取40 min，静置30 min后收集上清液，进行浓缩除醇后加去离子水溶至50 mL容量瓶中，备用［19］。使用时与甘油混合后加入海藻酸钠中。

2.1.2 壳聚糖膜液的制备 将一定量的壳聚糖溶于100 mL 0.5%的冰醋酸水溶液中，加入0.3%的蜂蜡和0.2%的司盘-40，混合后加热，于45 ℃条件下匀质2 min，室温静置过夜脱气，备用。

2.1.3 海藻酸钠膜液的制备 称取一定量的海藻酸钠，溶于100 mL的去离子水中，加入一定量甘油（加葡萄籽提取物），45 ℃加热搅拌溶解，室温下静置过夜脱气，备用。

2.1.4 复合膜的制备 将“2.1.2”中一定量壳聚糖膜液与“2.1.3”中一定量海藻酸钠膜液于45 ℃恒温加热搅拌混合均匀后，按比例加入“2.1.1”中葡萄籽提取物，继续混合30 min后，置于45 ℃、100 Hz超声脱气，倒入高透明亚克力板（30 cm×30 cm）上，玻璃棒涂布均匀，自然冷却10 min，于40 ℃烘箱鼓风干燥10 h，揭膜，备用。

2.2 复合膜性能评价指标及质量检测项目

2.2.1 抗拉伸强度 抗拉伸强度的测定参照GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的测定 第1部分：总则》［20］，选取光滑平整无损的复合膜剪成30 mm×20 mm规整长条，垂直平整地固定于拉力计电子测力仪上，初始间距为50 mm，拉伸速率为20 mm/min，每组复合膜做3个平行，记录膜断裂时最大抗拉记数以及位移量。抗拉伸强度计算公式：

[T=FLW]                                    （1）

式中，T为抗拉伸强度（MPa）；F为膜断裂时最大拉力（N）；L为膜平均厚度（mm）；W为膜样品宽度（mm）。

2.2.2 断裂伸长率 根据测定拉伸强度时的最大拉力相对应位移测量计算。断裂伸长率计算公式：

[E=L1-L0L0×100%]                          （2）

式中，E为断裂伸长率（%）；L0为拉伸前膜的长度（mm）；L1为拉伸后膜的长度（mm）。

2.2.3 复合膜厚度 复合膜厚度的测定参照GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片 厚度测定 机械测量法》［21］，选取光滑平整的复合膜，用厚度測量仪均匀选取10个点，每个点测3次，以平均值作为复合膜的厚度。

2.2.4 透光率 膜透光率测定参照程宇勤等［22］的方法。取规整的白色无损反光膜样，剪成一条白色长条，将这些白色长条均匀紧贴于干燥的反光玻璃中和比色皿一侧，在激光规定的照射温度和激光波长（523 nm）下用紫外分子激光和透光度测量计检测其紫外吸收透光度，以干燥洁净的白色空白反光玻璃中的比色皿一侧作为激光对照。

2.2.5 吸水率 膜吸水性的测定参照GB/T 1034—2008《塑料 吸水性的测定》［23］，将复合膜剪成2个薄膜长条（30 mm×20 mm），将复合膜浸入23 ℃去离子水中24 h，取出，根据复合膜开始试验时与吸水后的质量差异，将样膜放置于45 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重，取出称重记为W1，样膜浸泡后，取出称重记为W2。吸水率计算公式：

[WA=W2-W1W1×100%]                    （3）

式中，WA为吸水率（%）；W1为膜浸泡前干燥后质量（g）；W2为膜浸泡后质量（g）。

2.2.6 综合评分 拉伸强度和断裂伸长率是评价保鲜膜力学参数的重要指标，拉伸强度保证了保鲜膜的可用性及延展性，所以将此指标赋予70%的权重，断裂伸长率反映了保鲜膜的延展性，将其赋予30%的权重。每个指标试验测得最大数值为满分一百分，其他数值以此类推得分［24］。

综合评分=拉伸强度×70%+断裂伸长率×30%

（4）

2.3 单因素试验

2.3.1 海藻酸钠浓度的选择 分别配制浓度为0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、2.00%的海藻酸钠溶液，按照“2.1.4”中方法进行复合膜的制备，并进行评价，选择海藻酸钠浓度考察水平。

2.3.2 壳聚糖浓度的选择 分别配制浓度为0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、2.00%的壳聚糖溶液，按照“2.1.4”中方法进行复合膜的制备，并进行评价，选择壳聚糖浓度考察水平。

2.3.3 甘油浓度的选择 分别在制备过程中添加浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的甘油，按照“2.1.4”中方法进行复合膜的制备，并进行评价，选择壳聚糖浓度考察水平。

2.3.4 葡萄籽提取物添加量的选择 分别在制备过程中添加占甘油浓度0、10%、20%、30%、40%、50%的葡萄籽提取物，按照“2.1.4”中方法进行复合膜的制备，并进行评价，选择葡萄籽提取物添加量考察水平。

2.4 正交试验设计

在单因素试验结果基础上进行试验设计，以海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、甘油浓度和葡萄籽提取物添加量为影响因素设计正交试验，以复合膜综合评分为评价指标，并对结果进行分析，获得复合膜最佳制备工艺。

2.5 复合膜验证试验

对最佳制备工艺进行验证，并对复合膜进行质量评价。

2.6 复合膜抑菌性能

采用K-B法［25］测试葡萄籽提取物复合膜分别对大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。上述菌种接种于LB培养基中，培养至OD600 nm=0.8，作为菌悬液备用，取10 μL制备好的菌悬液均匀地涂在LB平板上，在培养基表面放置已制备好的葡萄籽提取物复合膜液，以无菌水作为阴性对照，以对控制菌有抑菌效果的药片为阳性对照，每个菌种做3组平行试验。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 海藻酸钠浓度对复合膜抗拉伸强度和断裂伸长率的影响 由图1、图2可知，当成膜液中海藻酸钠浓度在0.75%～1.50%时，复合膜的抗拉伸强度与断裂伸长率在一定范围内有所增大。因为随着海藻酸钠浓度增大，复合膜厚度增加。此外，海藻酸钠浓度增加亦使得膜液的稠度增加，则导致成膜液太黏，配制好的膜液不易脱气，最终不易流延成膜，而且还出现气泡较多、成膜层极度不均匀等现象；反之加入的海藻酸钠过少时其膜液浓度太稀，则流动性太大，会导致脱膜后揭膜困难，所得膜剂无实际利用价值。根据海藻酸钠纯溶液的黏度性质与单膜成膜特征结合单因素试验结果，选择1.00%～2.00%浓度的海藻酸钠溶液进行正交试验考察。

3.1.2 壳聚糖浓度对复合膜抗拉伸强度和断裂伸长率的影响 由图3、图4可知，复合膜抗拉伸强度随着壳聚糖浓度的增加先增大后下降，壳聚糖浓度为1.25%时达到峰值；复合膜断裂伸长率随着壳聚糖浓度的增加呈上升趋势，壳聚糖浓度为1.50%时最高，而后略有降低。在一定范围内，随着壳聚糖浓度增大，所制的膜剂厚度也增大，因此，复合膜的抗拉伸强度随着壳聚糖浓度的增加而增大；复合膜的断裂伸长率先增大又减小，其原因还有待于进一步研究。因此，选择0.75%～1.50%浓度的壳聚糖溶液进行正交试验考察。

3.1.3 甘油浓度对复合膜抗拉伸强度、断裂伸长率及综合评分的影响 由图5、图6、图7可知，随着甘油浓度的增加，复合膜的抗拉伸强度逐渐下降，而同时断裂伸长率整体上增加，这与甘油的化学性质密切相关，甘油又叫丙三醇，含有3个醇羟基，亲水性强，因此作为增塑剂与海藻酸钠结合生成氢键，阻碍了海藻酸钠与壳聚糖之间的静电结合能力，复合膜延展性和柔韧性增加，断裂伸长率增加，但同时抗拉伸强度减小。对于其综合评分可以看出，当甘油浓度为0.2%时综合评分最高，因此选择0.1%～0.4%浓度的甘油进行正交试验考察。

3.1.4 葡萄籽提取物添加量对复合膜抗拉伸强度和断裂伸长率的影响 由图8、图9可知，随着葡萄籽提取物添加量的增加，复合膜液的抗拉伸强度和断裂伸长度整体上先上升后下降，主要是因为随着葡萄籽提取物添加量增加，膜液稠度下降，因此选择10%～40%添加量的葡萄籽提取物进行正交试验考察。

葡萄籽提取物添加量//%][抗拉伸强度//MPa]

3.2 正交试验结果

根据单因素试验结果，采用L16（44）试验进行研究，试验因素与水平见表1，试验结果及方差分析见表2、表3。

通过正交试验结果可以看出，复合膜最佳成型工艺为A4B4C2D3，即海藻酸钠浓度2.00%、壳聚糖浓度为1.50%、甘油浓度0.2%、葡萄籽提取物添加量30%。通过正交试验，以复合膜抗拉伸强度为指标进行评价，从极差值可以看出，各因素影响大小为壳聚糖浓度>海藻酸钠浓度>葡萄籽提取物添加量>甘油浓度；以复合膜断裂伸长率为指标进行评价，各因素影响大小为海藻酸钠浓度>甘油浓度>葡萄籽提取物添加量>壳聚糖浓度；以综合评分为指标进行评价，各因素影响大小为壳聚糖浓度>海藻酸钠浓度>甘油浓度>葡萄籽提取物添加量，由此可见，对试验结果影响比较显著的因素为壳聚糖浓度和海藻酸钠浓度，这也与试验方差分析结果相一致，因此在试验研究过程中应注重对成膜材料配比的考察。同时发现葡萄籽提取物添加量亦会影响成膜效果，因此，将最佳工艺调整为A4B4C2D2，即海藻酸钠浓度2.00%、壳聚糖浓度1.50%、甘油浓度0.2%、葡萄籽提取物添加量20%，并将最佳工艺与调整工艺进行对比，结果显示，最佳工艺制备的复合膜抗拉伸强度为27.56 MPa，断裂伸长率为19.37%；调整工艺复合膜抗拉伸强度为29.42 MPa，断裂伸长率为19.87%，均优于最佳工艺，因此，选择调整工艺为本次试验的最佳工艺，并进行3次验证试验。

3.3 验证试验

从表4可以看出，调整工艺与最佳工艺相比，抗拉伸强度明显增强，断裂伸长率基本不变。因此，确定调整工艺为本研究的最佳工艺，即海藻酸钠浓度2.00%、壳聚糖浓度1.50%、甘油浓度0.2%、葡萄籽提取物20%。

表4 验证试验结果

[组别 抗拉伸强度//MPa 平均值 断裂伸长率//% 平均值 最佳工艺 29.87 29.86 19.85 19.55 29.56 19.23 30.14 19.56 调整工艺 31.06 31.25 19.48 19.70 30.92 19.74 31.77 19.88 ]

3.4 质量评价项目

取按照最佳工艺制备的复合膜，进行质量评价，每个项目平行3次重复。由表5可知，制得的复合膜厚度较厚，可能原因是膜液中添加了葡萄籽提取物，所以最终得到的复合膜比市场传统的PE保鲜膜（0.019 mm）偏厚。通过验证结果可知，优选的葡萄籽提取物制备复合保鲜膜最佳工艺，所制备的复合膜性能较好，该工艺可用于葡萄籽提取物制备食品保鲜膜。

3.5 葡萄籽提取物复合膜抑菌性能分析

对4种常见控制菌的抑菌直径大小对比结果见表6。由表6可知，葡萄籽提取物复合膜对大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果有所差异，其中对大肠杆菌效果最好，其抑菌圈直径可达7.4 mm，对铜绿假单胞菌的抑菌效果最差，仅有5.6 mm。由于本试验复合膜的制备中含有葡萄籽提取物，葡萄籽中含有的多酚有很强的抑菌效果，对多种微生物均有抑制作用，且抑菌效果会随多酚浓度的提高而增强［26］。另外由于复合膜含有的壳聚糖与海藻酸钠均有不同程度的抑菌作用，可能在与细菌细胞膜结合时导致细胞渗漏，从而抑制细菌生长。

4 小结与讨论

试验制得的复合膜抗拉伸强度较强；膜的断裂伸长率在标准范围内；膜的透光率较弱，可能原因是膜液中加入葡萄籽提取物，葡萄本身颜色呈紫红色，所以最终所得到的复合膜颜色较深；膜的含水率適中，因所制备的复合膜为可食性，所采用的材料均为可溶于水的，所以会导致最终膜的含水率受到影响。

本研究所得复合膜在力学性能、吸水率等方面均有不同程度的改善，但仍存在可以进一步研究探讨的方向，如在今后试验过程中可加强对葡萄籽提取物的脱色处理以增强复合膜的透光率；病原微生物的污染导致食物腐败和食源性疾病的传播，因此，抑菌能力是衡量食品包装膜性能的最重要特征，本研究在壳聚糖-海藻酸钠复合膜的基础上增加葡萄籽提取物，使制得的膜可用于活性食品包装的应用，以延缓微生物的生长，虽然壳聚糖和海藻酸钠自身有一定的抑菌效果，但其对膜剂的保鲜效果还需要进一步研究。

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